信号肽与分泌通路在毕赤酵母表达异源蛋白中的作用机制

农业部饲料生物技术重点开放实验室 张 勇 毛若雨 胡小媛

中国农业科学院饲料研究所 滕 达 王秀敏 王建华＊

饲用微生物工程国家重点实验室 大北农科技集团 王安如＊

大肠杆菌等原核生物表达系统因缺乏翻译后修饰系统导致诸多必要生物过程无法完成，如蛋白折叠、糖基化、磷酸化、硫酸化、蛋白质顺反异构、切除蛋白部分起始序列等，使所得重组蛋白具有不溶、不稳定、无功能性、具免疫源性等缺陷（Idiris 等 ，2010；Daly 和 Hearn，2005；Makrides，1996）。而毕赤酵母表达系统通过特有的翻译后修饰功能能有效弥补上述大肠杆菌的缺陷，许多在大肠杆菌中难以表达的外源蛋白在毕赤酵母中得以成功表达 （Daly 和 Hearn，2005；Lueking 等，2000；Monsalve 等，1999）。毕赤酵母表达外源蛋白分胞内表达和分泌表达两种形式（Doyle等，2009；Zhu等，2009），后者更具应用优越性，目的蛋白占分泌总蛋白比例高，有利于下游分离纯化（Daly和Hearn，2005）。迄今已有1000余种外源蛋白在毕赤酵母中成功分泌表达，有的表达量高达百分数级，但仍有不少在医药、食品、农业等领域有重要价值的蛋白或多肽，如人巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）、多巴胺D2S受体等无法实现高效表达（Damasceno 等，2011；Liu 等，2005；Macauley等，2005；Mochizuki等，2001）。 为解决这些问题，科学家从工程酵母构建、载体、启动子、培养条件、密码子、前导肽序列、翻译信号等各方面进行优化改进，取得了良好进展 （Daly和 Hearn，2005）。Idiris等（2010）研究认为，除信号肽外，分泌通路在外源蛋白高效分泌过程中起关键作用，因此成为突破蛋白质分泌瓶颈的焦点。本文就毕赤酵母信号肽关联的分泌机制、结构特征和蛋白分泌通路改造等方面的研究进展作一综述。

1 信号肽牵引的外源蛋白分泌通路假说

Gunter Blobel于20世纪70年代提出信号肽假说，认为蛋白质合成在核糖体上进行，信号肽作为蛋白质的一个片段引导核糖体定位于内质网通道上，并牵引合成的多肽穿过内质网通道，随后信号肽被肽酶切除，蛋白质被释放到内质网腔，由转运小泡转运到胞外。随后20年Blobel小组对这一过程做了深入研究，证实了该假说的正确性和普遍性（Matlin，2011）。毕赤酵母外源蛋白分泌机制符合“信号肽假说”理论，根据蛋白合成初期经胞质到内质网腔转运途径不同分为 “共转运”和“翻译后转运”两种分泌方式。

“共转运途径”在所有细胞中普遍存在，通过此途径分泌的蛋白多为膜蛋白，其信号肽翻译完成后，信号识别颗粒（SRP）识别信号肽序列和定位于内质网的信号识别颗粒受体，牵引新生肽链核糖体复合体至内质网易位子通道 （Idiris等，2010；Kida 等 ，2007；Halic 和 Beckmann，2005；Shan 和 Walter，2005；Mochizuki等，2001）。毕赤酵母表达蛋白多数以“翻译后转运”方式分泌胞外，即表达蛋白翻译后经转运途径进入内质网易位子通道，其N端信号肽序列的适度疏水中心具有逃避SRP识别的功能，待分泌蛋白通过与细胞质中伴侣分子结合保持未折叠或松散折叠状态，在信号肽牵引下与内质网上易位子通道蛋白Sec61复合体结合，与此同时ATP偶联内质网腔伴侣蛋白Bip通过ATP水解供能结合于多肽，牵引多肽进入内质网腔，信号肽在进入内质网腔过程中被信号肽酶切除掉，而信号肽C端引导肽则在由内质网转运至高尔基体过程中被位于高尔基体的Kex2 蛋白酶切割掉 （Rapoport，2007；Martoglio 和Dobberstein，1998）。信号肽被切割后，分泌蛋白在内质网腔和高尔基体完成翻译后加工修饰，如蛋白质折叠、二硫键形成、糖基化、磷酸化等，这些作用伴随着蛋白质转运而发生，且蛋白质分泌通路伴侣分子直接参与这些过程，之后成熟肽经转运小泡分泌到胞外 （Idiris等，2010；Rapoport，2007；Martoglio和 Dobberstein，1998）。

2 信号肽结构特征及其在转基因事件中的应用

信号肽是由15～50氨基酸组成的可切割序列，主导分泌过程，多位于分泌蛋白N端，也有位于 C 端的 （Damasceno等，2006；Kutay等，1995）。信号肽含三个结构域：带正电荷N端（1～5 AA，n-region）、疏水中心（7 ～ 15 AA）和作为信号肽酶切割位点的高极性C端（3～7 AA）（Martoglio等，1998；Kutay等，1995）。真核与原核生物信号肽在结构和功能上具相似性，但真核生物信号肽三个独特结构域肽链长度比细菌信号肽稍短（Von，1990）。这三个结构域分工负责完成蛋白分泌。信号肽N端正电荷区域影响蛋白穿膜的启动分泌，Inouye等（1982）对E.coli脂蛋白N端进行定点突变，使其分别带上+2，+1，0，-1 个电荷，脂蛋白产量随电荷数增多而增多，而带负电荷脂蛋白以未折叠形式存在于细胞质中。此外，“理想”信号肽疏水中心的8～10个Leu也直接影响分泌。Kikucli等（1989）设计 L8、L14、L6 等一系列信号肽观察信号肽疏水中心Leu含量对人溶菌酶 （hLZM）在酿酒酵母中心分泌效率的影响，发现hLZM分泌效率与信号肽疏水区肽链长度或Leu含量有关。C端即为信号肽酶切位点，在其-1和-3位上常见Pro和Gly等一些不带电荷的氨基酸残基，被称为“（-3，-1）-rule”，或有特定的切割支持作用（Martoglio 和 Dobberstein，1998；Nielsen 等 1997；Von，1989）。

迄今在毕赤酵母成功实现外源蛋白分泌表达的信号肽主要类型包括：（1）酿酒酵母α交配因子前导肽（α-MF）；（2）酿酒酵母转化酶信号肽（SUC2）；（3）毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽（PHO1）；（4） 一些蛋白自身信号肽 （Daly 和Hearn，2005；Cereghino 和 Cregg，2000）。不同信号肽对毕赤酵母表达分泌外源蛋白有不同影响，（Damasceno 等，2011；Daly 和 Hearn，2005）。α-MF信号肽在毕赤酵母表达中应用最为成功。α-MF源自于酿酒酵母α交配因子N端85氨基酸前导肽序列，包括N端19氨基酸信号肽和3个天冬氨酸连接糖基化的65肽（Waters等，1988）。关于外源蛋白在α-MF牵引下实现高效分泌表达的研究报道较多。Chandrasekhar等（2010）利用α信号肽成功实现了Insulin在毕赤酵母X-33中高效分泌表达，其产量高达到3.84 g/L；Zhang等（2011）利用含α信号肽的pPICZαA载体成功实现了plectasin及多拷贝基因在毕赤酵母X-33中的高效表达；同时，α信号肽在应用中较其他信号肽更为有效。Ghosalkar等（2008）用IFN-a2 b自身信号肽及α信号肽在毕赤酵母GS115中分泌表达，结果表明，α信号肽引导的目的蛋白高效分泌，产量达200 mg/L，而自身信号肽引导的不能分泌表达。Tanaka等（2004）使用嗜酸性木聚糖酶自身信号肽、α信号肽、酸性磷酸酶（PHO1）信号肽在GS115中分泌表达，结果显示，α信号肽引导的目的蛋白分泌表达量为其他两个信号肽的2倍。

酸性磷酸酶信号肽在毕赤酵母异源表达中应用也较多。Eldin等（1997）用酸性磷酸酶信号肽构建pHIL-S1表达载体，实现了单链抗体G5 sFv片段在GS115分泌表达，获纯化产品100～250 mg/L。木聚糖酶 （XynI）也通过酸性磷酸酶信号肽在GS115中成功分泌表达，纯化后产量达100 mg/L，但其产量略低于 α信号肽 （Koganesawa等，2001）。

大量研究表明，同一蛋白质可通过多种信号肽在毕赤酵母中分泌表达，但表达水平存在差异（Baumgartner等，2002；Koganesawa 等，2001）。 一些蛋白质自身携带的信号肽可能更便于在毕赤酵母分泌表达中发挥作用，如Baumgartner等（2002）将携带自身信号肽 PHA-E基因插入pPICZB载体并转化毕赤酵母X-33，植物血凝素表达量达100 mg/L，并具天然PHA-E同等生物活性。此外植物凝集素借助α信号肽也在毕赤酵母实现分泌表达，但目的蛋白氨基端信号肽加工困难，产物无活性（Daly和 Hearn，2005）。尽管诸多外源蛋白质在毕赤酵母成功高效表达，但仍有一些蛋白难以在毕赤酵母中分泌表达、或表达量低、信号肽加工难等 （Chandrasekhar等，2010；Li等，2009；Xie等，2008）。 目前提高外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达量是研究热点，其中信号肽及分泌通路改造是实现高效分泌表达的上游工作（Maresova 等 ，2010；Zhao 等 ，2009；Cereghino 和Cregg，2000）。

3 信号肽及外源蛋白分泌通路改造

3.1 信号肽Kex2切割位点序列改造 信号肽Kex2切割位点序列改造是提高外源蛋白分泌效率的常见策略之一 （Chandrasekhar等，2010；Maresova 等 ，2010；Xie 等 ，2008；Daly 和 Hearn，2005）。异源蛋白毕赤酵母分泌表达依赖于信号肽的牵引作用，后者在分泌过程中被Kex2蛋白酶所切割。该酶是酵母自身编码的具有Ca2+依赖性丝氨酸蛋白酶，属枯草杆菌蛋白酶家族，其加工蛋白前体、切除信号肽的特异性酶切位点为Lys-Arg/Arg-Arg/Pro-Ar （Rockwell和 Thorner，2004；Fuller等，1989）。研究表明，Kex2蛋白酶对Lys-Arg-位点的切割效率最高 （Southey等，2008；Bevan 等，1998）。 Bevan 等（1998）对 Kex2 不同切割位点的切割效率进行了研究，结果表明，Kex2对Lys-Arg-位点切割效率比Arg-Arg/Pro-Arg-要高。但Kex2蛋白酶往往由于切割效率不足导致目的蛋白N端带有未切除完整的信号肽序列（Zhao 等，2009；Kozlov 和 Yagudin，2008；Vedvick等，1991）。相关研究也表明，Kex2酶切位点的前后临近序列对酶的切割效率有很大影响，优化Kex2切割位点序列可有效提高Kex2切割效率，从而提高目的蛋白产量，该措施在胰岛素表达中应用较为成功 （Chandrasekhar等，2010；Wang和Ward，2008；Rozan，2004；Kjeldsen 等 ，1998）。Chandrasekhar等 （2010） 在 pPICZαA 载体 Kex2切割位点KR后添加EEAEAEPK间隔序列，使胰岛素前体在毕赤酵母X-33中产量提高2倍。Xie等（2008）在pPIC9K载体Kex2切割位点后也添加相同间隔序列，使胰岛素前体在毕赤酵母GS115分泌量增到3.6 g/L。此外，多功能氧化酶、青霉素酰胺化酶、牛胰腺RNA酶A、β乳球蛋白等重组毕赤酵母均有类似酶切序列成功改造的案例。研究表明，在载体Kex2切割位点和目的基因间插入EAEA间隔序列，均能增加Kex2切割效率，提高目的蛋白产量（Garcia 等，2012；Maresova等，2010；Li等，2009；Kim，1997）。但另一衍生问题是由于二肽酶Ste13对EAEA序列切割效率不高，使切割后目的蛋白N端带有延伸EA序列，多余的EA序列对目标蛋白的结构、功能的影响值得关注。也有研究表明，Kex2切割位点前的序列对于Kex2切割效率有一定的影响，对Kex2切割位点前的序列改造也可有效提高Kex2蛋白酶切割效率，使信号肽切割效率达100%，在紧邻Kex2蛋白酶切割位点序列前插入四肽序VAVE/VAFE/VAIE，可使信号肽被完全切割 （Wang和Ward，2008）。以上研究表明，信号肽切割位点临近序列改造的确能提高切割效率。

3.2 分泌通路对外源蛋白分泌效率的影响 外源蛋白翻译后修饰是伴随着蛋白分泌过程而发生的，在分泌通路作用下实现蛋白质折叠、二硫键形成、磷酸化等翻译后修饰，这些分泌通路因子大多为内质网腔伴侣蛋白。目前关于内质网腔结合于新生多肽疏水区促进蛋白折叠的伴侣蛋白 Bip、二硫键异构酶PDI、伴侣蛋白Sec63及伴侣蛋白辅因子YDJ1p和Ssa1p等对蛋白分泌效率的影响已被证实。PDI作为内质网腔伴侣蛋白，同时也是蛋白质二硫键形成异构酶，其与外源蛋白共表达能有效提高外源蛋白分泌量（Idiris等，2010）。 Inan 等（2006）用毕赤酵母X-33表达可作为十二指肠虫疫苗的美洲板口线虫分泌性蛋白Na-ASP1，发现增加基因拷贝数反而使Na-ASP1表达量减少，而将Na-ASP1与PDI共表达却使Na-ASP1分泌表达产量增加，且与Na-ASP1基因拷贝数有一定相关性。为探索各伴侣分子Bip、Sec63、PDI及辅因子YDJ1p和Ssa1p促进外源蛋白分泌效率的差异及互作，Zhang等（2006）分别将类激素蛋白（G-CSF） 分别与 Bip、Sec63、PDI、YDJ1、Ssa1p 在毕赤酵母GS115中共表达，结果G-CSF分别与Bip、Ssa1p、PDI共表达的分泌量提高了4～7倍；将 G-CSF 分别与 YDJ1/PDI、YDJ1/Sec63、Bip/PDI三个基因共表达，使G-CSF分泌产量分别提高8.7、7.6、6.5倍，认为多个伴侣蛋白共表达具显著的协同作用。

4 小结

综上所述，毕赤酵母兼具原核表达系统的“高效性”和真核表达系统的“优质性”优势，是表达各种功能蛋白和多肽的理想平台。突破蛋白质或多肽在毕赤酵母中高效分泌表达瓶颈往往对功能产物实现产业化至关重要。从受体菌、载体、启动子、密码子、培养条件等因素入手均已被证明是提高蛋白分泌效率的有效途径，但是基于信号肽尤其是信号肽通路元件或结构因子的改造与优化，或许是目前突破表达瓶颈的革命性技术策略之一，今后毕赤酵母高效分泌表达异源蛋白的主攻突破方向包括以下两点：一是信号肽及分泌通路改造与优化，这一环节为以往同类工作所忽略，既需要基于不同目标蛋白特性的个案研究，更需要积累大量工作以发现新的构效规律，获得具有普遍性的高效分泌表达的技术解决方案；二是蛋白质翻译后修饰（蛋白质转运、折叠、糖基化等）和质量控制系统（QC、UPR），及分泌蛋白的转运结构因子和辅助条件的系统研究。

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