耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因katG突变分析

甄伟 石大伟 赵玉玲 李辉 李亮 朱国峰

异烟肼（isoniazid，INH）是一种重要的抗结核药物，其在细菌体内被过氧化氢酶－过氧化物酶KatG氧化为乙酰异烟肼自由基和活性氧自由基等活性物质，进而攻击结核分枝杆菌多个 靶 位 点 来 发 挥 杀 菌 作 用［1］。Zhang等［1］通 过Southern印迹杂交（Southern blot）发现结核分枝杆菌katG基因缺失和异烟肼耐药相关。研究表明，异烟肼耐药与许多基因相关，发生频率最高的为katG编码区和inhA启动子区的突变［2－3］，katG315位突变最常见，有30%～94%的耐药株发生该突变［2，4］，但国内对于该基因其他位点的突变研究较少。本研究通过对河南省耐多药（multidrug resistant，MDR）结核分枝杆菌katG编码区全长突变进行分析，进一步分析异烟肼的耐药机制。

材料和方法

一、菌株来源

115株MDR结核分枝杆菌临床分离株（耐多药菌株）和22株利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素全敏感结核分枝杆菌临床分离株（药物敏感菌株）均来自于2007—2009年间河南省疾病预防控制中心115例新发和复发结核病患者晨痰标本。患者中男82例，女33例，年龄15～86岁。患者临床诊断主要依据结核分枝杆菌检测和胸部X线检查等，确诊所依据的诊断标准见参考文献［5］。新发是指之前从未被发现或诊断为肺结核但痰涂片阳性。复发是指涂阳肺结核患者在得到有效化疗后痰结核分枝杆菌转阴，但随病情已进入好转期或稳定期后痰结核分枝杆菌重新复阳，同时出现活动性肺结核临床表现或肺部X线病灶征象。药敏实验中所用H37Rv标准株来自于北京结核病胸部肿瘤研究所。菌株分离培养、鉴定方法及药敏实验的具体操作见参考文献［5］，药敏实验所用药物均购自Sigma公司。

二、结核分枝杆菌基因组DNA的提取和耐药相关基因的PCR扩增并测序

取菌株基因组DNA，具体操作按照参考文献［6］进行。采用Phusion DNA聚合酶（Finnzymes，Finland）扩增katG基因。katG基因编码区全长分两段进行扩增和测序。PCR扩增体系：采用50μl体系进行PCR检测，反应体系为：基因组 DNA 模 板 3μl，缓 冲 液 （buffer）10μl，二 甲 基 亚 砜（DMSO）1．5μl，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2μl，引物各0．5μl，DNA聚合酶0．5μl，ddH2O 32μl。反应循环条件为：预变性：98℃30s，98℃ 10s，65℃ 10s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸7min。测序引物序列见表1。有5株MDR菌株未得到可用于测序分析的PCR产物，因此可进行katG突变分析的菌株总数为110株。由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成测序。

三、测序数据的分析

应用软件SeqMan Pro（version 7．1，DNAstar Lasergene Inc，USA）将测序数据与参比序列进行比对分析。参比序列为结核分枝杆菌H37Rv的katG序列。比对后，若实验菌株的DNA序列与参比序列相同，则未发生突变；若不同，则为发生突变，并记录突变位点的具体类型和频率。

结 果

一、耐多药菌株和药物敏感菌株katG基因突变概况

1．耐多药菌株katG突变概况：在110株MDR结核分枝杆菌中均检测到katG基因突变（表2），突变位点有40个（以密码子编号计算），其中同义突变为katG24和katG390。在结核分枝杆菌耐药相关基因突变和多态性数据库（www．tbdreamdb．com）中检索上述40个突变位点，有19个突变位点未见记录（包括同义突变katG24），有6个突变类型未见记录（包括同义突变katG390）。

表1 katG基因PCR扩增和测序相关信息

表2 异烟肼耐药相关基因katG突变特征（按突变位点组合分析）

2．异烟肼敏感对照菌株katG突变概况：22株药物敏感株中，仅在463位密码子发现了突变，数目为20株，其他位点未检测到突变。

二、异烟肼耐药菌株katG基因突变类型和频率

具体见表2。除去仅有同义突变或katG463突变的菌株9株，共101株MDR结核分枝杆菌发生katG基因突变，占91．8%（101／110），其中发生katG315突变的菌株最多，有68株，占61．8%（68／110），发生katG其他位点突变的菌株33株，占30．0%（33／110）。89．7%（61／68）的katG315突变为AGC→ACC （Ser→Thr），其余为 AGC→AAC （Ser→Asn）。单独发生katG315突变的有4株，katG315联合katG463突变的有54株，其余10株均发生katG315、katG463和第三个位点的联合突变；其次是katG428，有4株发生该突变，占3．6%（4／110），但这4株同时也发生katG315突变；发生其他单点突变菌株数目较少，为1或2株，但总数较大，共33株。

讨 论

研究表明，50%以上异烟肼耐药株发生katG315突变，突变频率存在地区、研究群体的差异［7－10］。本研究中有61．8%（68／110）的菌株发生katG315突变，明显低于俄罗斯（93．6%）［9］和巴西（87．1%）［11］，与中国东部（64．4%）［12］和北京（60．6%）［13］接近，高于中国香港（41．5%）［14］。MDR菌株对该突变的选择压力可能是造成此差异的原因之一，在中国东部5省的一项研究中，单耐异烟肼的结核分枝杆菌中有64．4%发生katG315突变［12］，低于同样在中国东部开展但针对MDR结核分枝杆菌的研究所报道的突变频率（72．7%，176／242）［15］。

本研究中katG基因各位点总突变率为91．8%（101／110），与现有报道无明显差别［12］。katG315最主要突变类型是 AGC→ACC（89．7%，61／68），与多数研究一致［7－8，16］。本研究中，发生katG463突变菌株数目为103株，但对照菌株也发现该突变，这显示该突变为多态性位点，多分布在亚洲、俄罗斯［17－18］，可 能 与 异 烟 肼 耐 药 无 关［19－20］。 但 目 前 关 于 该位点和异烟肼耐药关联与否存在争论。有研究表明具有katG463突变的结核分枝杆菌表现出和野生型相同的过氧化物－过氧化氢酶活性［21］，且该位点突变不能改变其酶活性［22］，但同时有研究发现该位点与低 水平耐药有关［12，22］。除去同义突变和多态性位点katG463，本研究中突变频率katG428为3．6%（4／110），列第二位。目前为止，该突变未见其他文献报道，且这4株菌同时也发生katG315突变，推测该位点对异烟肼耐药可能不起主要作用。

目前认为结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子机制涉及katG、inhA启动子区、ahpC、oxyR等多个基因，为了达到较高的灵敏度，异烟肼耐药性分子检测也通常基于多个基因及其突变的联合检测。研究显示在检测katG315突变的基础上，联合检测inhA－15可以增加8．3%的异烟肼耐药预测灵敏度，联合检测ahpC－10可以增加3．7%的灵敏度［15］。本研究通过对katG基因编码区全长进行分析，发现katG基因315位点外的低频单点突变广泛存在于异烟肼耐药结核分枝杆菌中，但在22株敏感对照菌株中并没有发现这些突变，提示这些突变可能与异烟肼耐药相关，但仍需要更大样本的菌株群体检测，来验证这些突变与异烟肼耐药性的关系。本研究中发现除katG315之外的39个突变位点，其中7个位点与katG315联合突变。Chan等［14］在中国香港的一项研究中也对katG基因全长进行了测序分析，得到katG315外的31个低频单点突变位点（其中有7个位点与katG315联合突变），30个突变位点与异烟肼耐药相关，有3个位点（katG155、katG127、katG289）在本研究中也发现相同突变。

综上所述，katG315外的katG基因其他突变位点可能在异烟肼耐药分子机制中存在作用，但仍需在更大样本的菌株群体中和通过体外遗传操作来验证。而对于异烟肼耐药性的预测，通过检测katG基因编码区全长的突变可以获得与检测多个基因的突变相似的高灵敏度。

［1］Zhang Y，Heym B，Allen B，et al．The catalase－peroxidase gene and isoniazid resistance ofMycobacteriumtuberculosis．Nature，1992，358（6387）：591－593．

［2］Mokrousov I，Otten T，Filipenko M，et al．Detection of isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisstrains by a multiplex allele－specific PCR assay targetingkatGcodon 315variation．J Clin Microbiol，2002，40（7）：2509－2512．

［3］Banerjee A，Dubnau E，Quemard A，et al．inhA，agene encoding a target for isoniazid and ethionamide inMycobacterium tuberculosis．Science，1994，263（5144）：227－230．

［4］Kim SY，Park YJ，Kim WI，et al．Molecular analysis of isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosisisolates recovered from South Korea．Diagn Microbiol Infect Dis，2003，47（3）：497－502．

［5］中国防痨协会．结核病诊断细菌学检验规程．中国防痨杂志，1996，18（1）：28－31．

［6］van Soolingen D，Hermans PW，de Haas PE，et al．Occurrence and stability of insertion sequences inMycobacterium tuberculosiscomplex strains：evaluation of an insertion sequencedependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis．J Clin Microbiol，1991，29（11）：2578－2586．

［7］Musser JM，Kapur V，Williams DL，et al．Characterization of the catalase－peroxidase gene（katG）andinhAlocus in isoniazid－resistant and－susceptible strains ofMycobacterium tuberculosisby automated DNA sequencing：restricted array of mutations associated with drug resistance．J Infect Dis，1996，173（1）：196－202．

［8］Haas WH，Schilke K，Brand J，et al．Molecular analysis ofkatGgene mutations in strains ofMycobacterium tuberculosiscomplex from Africa．Antimicrob Agents Chemother，1997，41（7）：1601－1603．

［9］Mokrousov I，Narvskaya O，Otten T，et al．High prevalence of KatG Ser315Thr substitution among isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisclinical isolates from northwestern Russia，1996to 2001．Antimicrob Agents Chemother，2002，46（5）：1417－1424．

［10］Marttila HJ，Soini H，Eerola E，et al．A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug－resistantMycobacterium tuberculosisisolates originating from the St．Petersburg area in Russia．Antimicrob Agents Chemother，1998，42（9）：2443－2445．

［11］Silva MS，Senna SG，Ribeiro MO，et al．Mutations inkatG，inhA，andahpCgenes of Brazilian isoniazid－resistant isolates ofMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，2003，41（9）：4471－4474．

［12］Zhang M，Yue J，Yang YP，et al．Detection of mutations associated with isoniazid resistance inMycobacterium tuberculosisisolates from China．J Clin Microbiol，2005，43 （11）：5477－5482．

［13］Jiao WW，Mokrousov I，Sun GZ，et al．Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistantMycobacterium tuberculosisstrains from Beijing，China．Chin Med J（Engl），2007，120（9）：814－819．

［14］Chan RC，Hui M，Chan EW，et al．Genetic and phenotypic characterization of drug－resistantMycobacterium tuberculosisisolates in Hong Kong．J Antimicrob Chemother，2007，59（5）：866－873．

［15］Luo T，Zhao M，Li X，et al．Selection of mutations to detect multidrug－resistantMycobacterium tuberculosisstrains in Shanghai，China．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（3）：1075－1081．

［16］菅记涌，王嫩寒，易俊莉，等．MTBDR plus方法快速检测北京地区临床结核分枝杆菌分离株利福平和异烟肼耐药性效果评价．中国防痨杂志，2010（10）：611－614．

［17］Lee AS，Tang LL，Lim IH，et al．Lack of clinical significance for the common arginine－to－leucine substitution at codon 463 of thekatGgene in isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisin Singapore．J Infect Dis，1997，176（4）：1125－1127．

［18］Kurepina NE，Sreevatsan S，Plikaytis BB，et al．Characterization of the phylogenetic distribution and chromosomal insertion sites of fiveIS6110elements inMycobacterium tuberculosis：non－random integration in the dnaA－dnaN region．Tuber Lung Dis，1998，79（1）：31－42．

［19］van Doorn HR，Kuijper EJ，van der Ende A，et al．The susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto isoniazid and the Arg→Leu mutation at codon 463ofkatGare not associated．J Clin Microbiol，2001，39（4）：1591－1594．

［20］Herrera L，Valverde A，Saiz P，et al．Molecular characterization of isoniazid－resistantMycobacterium tuberculosisclinical strains isolated in the Philippines．Int J Antimicrob Agents，2004，23（6）：572－576．

［21］Johnsson K，Froland WA，Schultz PG．Overexpression，purification，and characterization of the catalase－peroxidase KatG fromMycobacterium tuberculosis．J Biol Chem，1997，272（5）：2834－2840．

［22］Rouse DA，DeVito JA，Li Z，et al．Site－directed mutagenesis of thekatGgene ofMycobacterium tuberculosis：effects on catalase－peroxidase activities and isoniazid resistance．Mol Microbiol，1996，22（3）：583－592．