载脂蛋白E基因多态性与中青年脑梗死的相关性研究

王静 钟聪敏 田西菊 王秀娟 程华

（1.河北省保定市第一医院神经内科，河北 保定 071000；2.河北省保定市第三医院神经内科，河北 保定 071000）

中青年脑梗死是指发病年龄在18～45岁的脑梗死。近年来，脑梗死人群有年轻化的趋势。众所周知，脑动脉粥样硬化是脑梗死的病理基础，而早发性动脉粥样硬化是中青年脑梗死的重要病因［1］。动脉粥样硬化分子遗传学的研究已从血脂水平深入到脂蛋白、载脂蛋白水平。载脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）是一种多态性蛋白，在介导和调节多种与动脉粥样硬化有关的脂类代谢中均起关键作用，它通过多种途径影响动脉粥样硬化的形成。国内关于apoE基因多态性与脑梗死的相关性研究已有报道［2－3］，但罕有对中青年人群中脑梗死与apoE基因多态性相关性的报道［4］。本课题研究了青年人群中apoE基因型的频率及分布，以探讨apoE基因多态性与中青年人群脑梗死发病风险的关系，对脑梗死的预防和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河北省保定市第一医院2010年9月—2012年9月被确诊为脑梗死的110例汉族中青年住院患者作为中青年脑梗死组，平均年龄（35.0±9.5）岁，其中男性73例、女性37例。所有患者的诊断均符合第4届全国脑血管病学术会议制定的诊断标准［5］，经颅脑CT或MRI检查确诊。排除心源性、动脉炎、脂肪栓子、药物、肿瘤等引起的脑梗死和肝、肾及血液系统疾病，无抗凝及溶栓治疗史。对照组为我院同期体检的126例汉族中青年健康者，平均年龄（36.0±10.8）岁，其中男性86例、女性40例。采集标本前均已明确告知并签署知情同意书。2组年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取晨起空腹12～14 h的抗凝静脉血3 mL，采用NaCl盐析法提取外周血白细胞基因组DNA，－20℃保存。

1.2.2 试剂 抗凝剂、DNA提取试剂、红细胞裂解液（军事医学科学院研究室）；TE缓冲液、储存液SDS、蛋白酶K（美国Sigma公司）；PCR试剂：4种dNTPs（Sigma公司），引物：上游引物序列5′－AACAACTGACCCCGGTG－GCG－3′和下游引物序列5′－ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC－3′，反应引物按文献［6］设计，由中山大学基因中心合成。10%二甲基亚砜、Taq DNA聚合酶（美国Sigma公司），10倍PCR缓冲液（美国Sigma公司）。电泳试剂：2%琼脂糖凝胶、限制性内切酶 HhaⅠ（美国Sigma公司）、限制性内切酶缓冲液（美国Sigma公司）。

1.2.3 apoE基因的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增 扩增apoE基因第4外显子中含多态性位点的DNA片段，扩增产物长度299 bp。PCR反应体系：基因组 DNA：0.5μg，4种dNTPs终浓度200μmol／L，引物终浓度0.2μmol／L，10%二甲基亚砜5μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，10倍PCR缓冲液5μL，最后加水至终体积50μL。反应体系用50μL石蜡油覆盖，94℃预变性4 min；然后94℃变性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，进行35个循环；最后72℃再延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳时间1 h。溴化乙啶染色，在UV灯下发橘红色荧光，检测扩增结果呈现299 bp的扩增产物。

1.2.4 apoE基因的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析 取扩增产物5μL，加入6 U HhaⅠ内切酶及其缓 冲 液，加 双 蒸 水 （double distillated water，ddH2O），使总体积达20μL，37℃消化4～5 h。将酶切产物于5%聚丙烯酰胺凝胶中，进行8 V／cm垂直电泳，将电泳凝胶进行溴化乙啶室温染色40 min后水洗，紫外灯下观察DNA带型并摄影。按照Hixson等［7］的方法进行apoE基因分型，根据3种等位基因特异性片段的不同，可在电泳图谱上鉴定apoE基因不同的基因型。经特异性限制内切酶消化后apoE的PCR产物片段可能出现6种片段大小的组合：ε2／2为91、83、61 bp；ε3／3为91、61、48、35 bp，ε4／4为72、61、48、35 bp；ε2／3为91、83、61、48、35 bp；ε2／4为91、83、72、61、48、35 bp；ε3／4为91、72、61、48、35 bp。参考标准物根据长度片段确定待测样品apoE基因型，见图1。

1.2.5 基因型和等位基因频率计算方法 基因型频率＝基因型频数／总例数；等位基因频率采用平衡法：ε2＝ε2／2＋1／2（ε2／3＋ε2／4）；ε3＝ε3／3＋1／2（ε2／3＋ε3／4）；ε4＝ε4／4＋1／2（ε3／4＋ε2／4）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计数资料比较采用χ2检验，检验标准α＝0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 apoE基因呈多态性 apoE基因有6种基因型，即3种纯合子（ε2／2、ε3／3、ε4／4）和3种杂合子（ε2／3、ε3／4、ε2／4）。

图1 apoE基因PCR－RFLP产物电泳结果

2.2 2组患者apoE基因型频率 2组患者apoE基因型分布以ε3／3多见，在健康对照组为66.7%，中青年脑梗死组为46.4%；2组ε3／3和ε4／4基因型频率分布差异均有统计学意义（P均＜0.05），ε2／2、ε2／3、ε2／4和ε3／4基因型频率分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

2.3 2组apoE等位基因频率 2组ε3、ε4等位基因频率分布差异均有统计学意义（P均＜0.05），ε2等位基因频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 中青年脑梗死组与对照组apoE基因型频率比较［%（n）］

表2 中青年脑梗死组与对照组apoE等位基因频率比较［%（n）］

3 讨 论

apoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，参与机体血脂代谢及调节胆固醇平衡，在动脉硬化的发生、发展过程中起着重要的作用。apoE的合成是由位于一个基因位点上的3个等位基因所控制，即ε2、ε3和ε4，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生3种纯合子（ε2／2，ε3／3，ε4／4）和3种杂合子（ε2／3，ε2／4，ε3／4）共6种常见表型，apoEε3／3型为野生型，ε2和ε4是由其变异而来。

apoE基因多态性具有种族差异，在对汉族人群apoE基因频率研究中发现，各年龄组差异无统计学意义，ε3为最常见的等位基因。本研究结果显示，在中青年人群对照组中ε3／3基因型最多（66.7%），ε3等位基因出现频率均显著高于ε2和ε4（P均＜0.05），与对汉族人基因频率研究结果相一致［8］。

近年来，国内外对apoE的基因多态性与脑梗死相关性的研究较多。Sheng等［9］通过对缺血再灌注小鼠的研究发现，ε3转基因鼠的神经损害程度小于ε4转基因鼠，提示ε3有助于脑梗死发病后的神经修复。本研究以河北省保定地区汉族中青年人群为背景，也发现在脑梗死组ε4／4基因型频率、ε4等位基因频率显著高于对照组（P＜0.05）；ε3／3基因型频率、ε3等位基因频率较对照组降低（P＜0.05），从而可以进一步证实ε3等位基因是中青年脑梗死的保护性基因，而ε4等位基因可能是中青年脑梗死的一种遗传易感因子［3－4］。但是也有研究［10－11］并未发现apoE基因多态性与脑梗死之间存在相关性。

中青年脑梗死最常见的危险因素为高血压病、吸烟、饮酒，其次为血脂异常、糖尿病、高同型半胱氨酸血症等，有研究［12－13］证实，apoE 基因多态性是影响2型糖尿病患者发病的一个重要遗传因素，且2型糖尿病患者中ε4携带者具有较高的脑梗死易感性。ε4等位基因通过多种机制使血浆胆固醇水平增高，进而导致脑梗死的发生［14］。

总之，本研究认为apoE基因多态性与中青年脑梗死密切相关，进行apoE基因多态性分析对脑梗死的早期发现、早期治疗具有重要意义。

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