高分辨率熔解曲线分析对96例精神分裂症与96例对照DISC1基因外显子的突变检测*

龙 逢 王筱静 陈 星 陈 刚

精神分裂症是一种重型精神疾病，以思维、情感、行为障碍与相互不协调为主要特征。在一般人群中终生患病率约为6.55‰［1］，至今病因未明。家系调查、双生子及寄养子研究均显示遗传因素与发病密切相关［2～4］，遗传方式复杂，显性、隐性及多基因遗传方式均有报道。迄今发现，许多基因与精神分裂症相关联，其中DISC1(精神分裂症断裂基因1)被列为重要的易感基因，我们的Affymetrix人类SNP6.0芯片对两组精神分裂症的全基因组关联分析结果也均发现与此基因存在关联(数据未发表)。本研究采用了高分辨率熔解曲线(HRM)分析的技术方法，对DISC1基因的全部外显子区域在96例精神分裂症患者和96例正常对照者进行了突变筛查，结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2004年8月在山东省济南市精神卫生防治中心与济南市历城区锦绣川精神病疗养院医院住院的精神分裂症患者(以下简称患者)96例;正常对照者96例(以下简称对照者)取自山东省血液中心献血者。所有患者均符合国际疾病分类第十次修订本(ICD-10)精神分裂症诊断标准，其中男73例，女23例，年龄23～73 岁，平均年龄(40.80 ±9.49)岁，平均发病年龄(26.68±5.70)岁，患者间均无血缘关系。对照者中男63例，女33例，年龄18～53岁，平均年龄(23.09±3.01)岁。本研究得到了山东省医学科学院基础医学研究所伦理委员会的批准，并获得了患者与对照者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA制备 抽取患者与对照者的外周静脉血5 ml，用EDTA做抗凝处理后－20℃冷冻保存。DNA采用厦门百维信生物科技有限公司 (Bio-V)的Lab-Aid 820自动核酸提取仪与500 μl全血磁珠提取核酸试剂提取。DNA浓度用美国赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific的NanoDrop 2000分光光度计检测，每个样本测定两次，取其平均值。如果两次误差超过10%，则进行第3次测定后取两个相近数值的平均值。最后将所有DNA样品稀释至终浓度1 ng/μl，用96深孔板(2 ml)－20℃冻存备用。

1.2.2 DNA模板分装 用美国 APRICOT DESIGNs Personal Pipette PP-550N-XD移液工作站分装5 μl(5 ng)至96孔PCR板(宁波)。

1.2.3 引物设计与合成 选用美国加州大学的基因组生物信息学网站UCSC Genome Bioinformatics(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，输入DISC1基因，在众多转录本中选择最长(外显子最多)的一 个，在 HumanGeneDISC1(uc010pxh.2)Description and Page Index页面，通过 Exon Primer(外显子引物)，选择Entire(全部)cDNA;引物序列提交上海博尚生物技术有限公司合成，见表1。

1.2.4 PCR 反应 基因组 DNA 5 μl(1 ng/μl)，10 ×EasyTaq buffer 2.0 μl(Trans Gen Biotech 全式金)，10 mM dNTPs 0.2 μl，5 μM Primer FR(左右)各 1.2 μl，5 μM SYTO9(饱 和 荧 光 染 料)1.5 μl，Easy Taq polymerase(Trans Gen Biotech 全式金)(5 U/μl)0.2 μl，加 ddH2O 9.1 μl使总反应体系为 20 μl。PCR 反应在美国 Applied Biosystem，ABI公司的 GeneAmp PCR System 9700扩增仪上进行，其反应条件如下:95℃预变性5 min;95℃变性30 s，56～59℃ 退火2 min，72℃延伸30 s，共50个循环;然后72℃保温7 min，最后保存于25℃。

1.2.5 高分辨率熔解曲线分析基因扫描 (High Resolution Melting for Gene Scan) 对DISC1外显子序列的突变检测采用了美国公司的高分辨熔解曲线基因突变/基因分型检测系统(Idaho Technology，Light Scanner HI 96)。高分辨熔解曲线分析采用LightScanner(HRM)高分辨率熔解曲线突变检测/基因分型分析系统，温度设置从65℃升至95℃。

1.2.6 统计分析 对最终得到的所有26对引物扩增后的PCR产物的基因扫描通过随机所带的Instrument＆Analysis软件，Light Scanner wit Call-IT 2.0软件完成。首先在 http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND/.silico得到经由电脑模拟的PCR产物的熔解曲线(见图1)，将其与实验中真实得到的PCR熔解曲线进行对比，通过对比吻合情况检验PCR扩增质量。荧光染料结合在DNA双链，当温度逐渐上升到一定程度，双链的PCR产物就会解链，荧光染料会随之开始逐渐脱落，完全解链后会全部脱落，这种变化会通过荧光曲线的下降直观地反映出来。如果对照者与患者在这一段PCR产物的DNA序列完全一致，那么二者得到熔解曲线形状就会完全吻合。有突变时解链的温度会出现改变，表现为熔解曲线形状改变。因此，通过与对照者熔解曲线作对比，会发现患者存在的突变。另外，患者与对照者的一般统计学数据通过Microsoft Office Excel XP软件完成。

图1 DISC1 Exon13.4理论模拟PCR产物熔解曲线

表1 精神分裂症DISC1基因外显子突变检测引物序列

对DISC1基因全部13个外显子的序列用26对引物经过PCR扩增后进行了高分辨率熔解曲线突变检测，将96例患者与96例对照者的熔解曲线进行逐一对比，结果未发现突变，见图2。

2 结果

图2 DISC1 Exon13.496例对照者与96例患者的熔解曲线

3 讨论

DISC1位于1号染色体的q42.2;全长约410 kb，包含13个外显子，已发现有16个转录本。此基因编码854个氨基酸的蛋白质，包括一个富含丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸的球状N段区和一个由3～13号外显子编码形成的卷曲的C段区。羧基端区域富含许多环状结构域，有利于 DISC1与其他蛋白间的结合［5，6］。

1990 年，St.Clair［7］对苏格兰某精神病高发家系的研究发现该家系中精神疾病患者的1q42存在易位突变。其平衡易位断点部位位于染色体(1;11)(q42.1;q14.3)。2000 年，Millar等［8］发现了两个直接被易位突变影响的基因，并命名为DISC1和DISC2。Millar认为这两个基因是精神疾病的易感基因。

DISC1在成体和胚胎的许多组织中都有表达，在胎盘和脑中表达较高，在神经元的轴突末端、突触后区域、线粒体、中心体、内质网及细胞核均有表达［9］。DISC1在脑组织中的发育是一个动态变化的过程，在人类发育的不同阶段，各个部位表达的高低不同。这种表达模式表明DISC1基因在神经元发育和成熟过程中起到重要作用［10］。

DISC1与许多基因相互作用构成了精神疾病发病机制。2003年，Morris等［11］发现DISC1与多种中心体的和细胞骨架系统的蛋白如MIPT3，MAP1A，NUDEL，细胞膜上的受体蛋白如ACTN2，以及受体信号转换蛋白如ATF4，ATF5相互作用。DISC1还参与了 LIS1/NUDE/NUDEL通路参与的微管活动，与微管蛋白和中心粒旁素也有结合，DISC1以及DISC1/NUDEL的结合参与了对神经突生长的调控。DISC1上有特殊的区域用于与以上蛋白的相互作用，敲除DISC1或突变的DISC1与以上蛋白的结合和相互作用发生改变，从而影响神经突的生长发育，以及影响细胞内物质转运等生理活动。所以Morris等认为DISC1基因产物是多功能蛋白，DISC1基因的突变会破坏细胞间传导、神经突构造和神经元迁移，从而导致精神分裂症易感性升高。

2005年，Millar等［12］发现 DISC1与磷酸二酯酶-4B(PDE4B)的UCR2区的结合和相互作用与精神分裂症的易感有关。这个结合是cAMP依赖性的，细胞cAMP水平升高可导致PDE4B与DISC1分离并恢复PDE4B的活性。DISC1可以通过与PDE4B的结合对其活性产生调控，这个过程可能与精神疾病的发病有关。

2009年，Mao等［13］研究发现 DISC1 通过调节GSK3-beta(糖原合成酶激酶3β)的活性和beta-catenin控制神经前体细胞增殖。DISC1直接作用于Gsk3β，并抑制重组体Gsk3β的活性，导致其磷酸化水平降低，β-catenin的稳定性升高。DISC1敲减的成年小鼠大脑齿状回极度活跃并出现抑郁样行为，但这些DISC1敲减引起的作用可被药物抑制Gsk3β改变。

2003年，Hennah等［14］发现 DISC1基因上的一个重要区域HEP3。HEP3是一个跨越DISC1基因第一内含子到第二外显子的单体型，包含 2个 SNP。Hennah等发现HEP3在芬兰女性患者中不能有效的传递。HEP3单体型的传输失真具有性别差异，只在女性患者中不能有效传递。2004年，Hodgkinson等［15］通过对北美人群的病例对照研究证实HEP3单倍体的不充分表达与情感性精神分裂症相关，同时从第1外显子到第9外显子的4个单倍型域中的多个单倍体型与精神分裂症、情感性精神分裂症、双向情感障碍有关。他们还发现情感性精神分裂症患者的DISC1基因上leu-607-pro有错义突变过度表达现象。

基因的外显子作为基因内的编码序列，显示转录成mRNA，然后在蛋白质生物合成过程中翻译成蛋白质。因此，外显子突变将影响基因的表达，并影响神经系统的发育和成熟，导致各种精神疾病的发生。对外显子突变的检测将有助于我们研究DISC1基因对精神疾病易感性的影响，并发现其影响精神疾病发病的病理生理机制。

高分辨率熔解曲线是由美国犹他大学保健科学中心病理学部Carl Wittwer实验室与美国Idaho公司于2003年共同开发的一种建立在实时荧光定量PCR基础上的技术，是通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化从而对DNA结构进行分析的一种技术。其原理是在DNA扩增的过程中加入饱和染料，并使饱和染料镶嵌在扩增的DNA双链之间。因此，一段双链DNA分子在被加热变性时，根据其GC含量和分布的差异，在不同的温度解链，释放出饱和染料，从而形成不同的熔解曲线。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，具有高灵敏度特异性、简单方便、成本低、高通量等优点，可应用于基因分型和突变检测等方面。本实验使用HRM技术检测了DISC1基因全部13个外显子的突变情况，体会了检测过程的快速、简便、高通量，并且灵敏性和特异性较高［16～20］。

在此之前，Hennah［14］，Hodakinson［15］等均对DISC1基因进行过突变研究，然而却只是针对某个或某些位点进行研究，本实验对DISC1基因的全部13个外显子进行设计合成了引物，对所有96个精神分裂症样本都进行了检测，因此，是针对DISC1在精神分裂症的一项系统而全面的实验。其结果未发现突变的原因可能有以下两点:(1)用于研究的患者样本数量不够大;(2)DISC1基因涉及精神分裂症病因DNA变异存在于外显子之外的其他DNA序列中，而外显子中根本就不存在突变。

总之，本文系统全面地完成了对96例精神分裂症患者的DISC1基因全部13个外显子的突变检测，未能发现突变，这对以后的研究有重要参考意义。同时也提示研究既要重视DISC1基因外显子区域(如:进一步扩大研究样本)，更要着眼于其外显子之外的DNA区域(如:基因调控区，剪切与内含子区域等)。

［1］沈渔邨，张维熙，李淑然，等.1993年中国7地区精神疾病、精神卫生服务和精神与智力残疾流行病学调查［J］.医学研究通讯，2000，29(6):14－15

［2］Heston LL.Psychiatric disorders in foster home reared children of schizophrenic mothers［J］.Br J Psychiatry，1966，112(489):819－825

［3］Onstad S，Skre I，Torgersen S，et al.Twin concordance for DSM-III-R schizophrenia［J］.Acta Psychiatr Scand，1991，83(5):395－401

［4］Tsuang MT，Kendler KK，Gruenberg AM.DSM-III schizophrenia:is there evidence for familial transmission［J］.Acta Psychiatr Scand Suppl，1985，319:77－83

［5］Hodgkinson AC，Goldman D.Disrupted in schizophrenia(DISC1):association with schizophrenia，schizoaffective disorder，and bipolar disorder［J］.Am J Hum Genet，2004，75(5):862－872

［6］Lipska B，Peter T.Expression of DISC1 binding partners is reduced in schizophrenia and associated with DISC1 SNPs［J］.Human Molecular Genetics，2006，15(8):1245－1258

［7］St Clair D，Blackwood D，Evans HJ，et al.Association within a family of a valanced autosomal translocation with major mental illness［J］.Lancet，1990，336(8706):13－ 16

［8］Millar JK，Wilson-Annan JC，Anderson S，et al.Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia［J］.Hum.Molec.Genet，2000，9:1415－1423

［9］James R，Adams RR，MIllar JK，et al.Disrupted in schizophrenia 1(DISC1)is a multicompartmentalized protein that predominantly localizes to mitochondria［J］.Mol Cell Neurosci，2004，26(1):112－122

［10］Meyer KD，Morris JA.Immunohistochemical analysis of DISC1 expression in the developing and adult hippocampus［J］.Gene Expr Patterns，2008，8(7－8):494－501

［11］Morris JA，Kandpal G，Ma L，et al.DISC1(disrupted－ in－schizophrenia 1)is a centrosome－associated protein that interacts with MAP1A，MIPT3，ATF4/5 and NUDEL:regulation and loss of interaction with mutation［J］.Hum.Molec.Genet，2003，12:1591－1608

［12］Millar JK，Pickard BS，Mackie S，et al.DISC1 and PDE4B are interacting genetic factors in schizophrenia that regulate cAMP signaling［J］.Science，2005，310:1187－1191

［13］Mao Y，Ge X，Frank CL，et al.Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3-beta/beta-catenin signaling［J］.Cell，2009，136:1017－1031

［14］Hennah W，Varilo T，Kestila M，et al.Haplotype transmission analysis provides evidence of association for DISC1 to schizophrenia and suggests sex-dependent effects［J］.Hum.Molec.Genet，2003，12:3151－3159

［15］Hodgkinson CA，Goldman D，Jaeger J，et al.Disrupted in schizophrenia 1(DISC1):association with schizophrenia，schizoaffective disorder，and bipolar disorder［J］.Am.J.Hum.Genet，2004，75:862－872

［16］Michael Krypuy，Genni M Newnham，David M Thomas，et al.High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples:KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer［J］.BMC Cancer，2006，6:295

［17］D Kramer A，FB Thunnissen A，MI Gallegos-Ruiz，et al.A fast，sensitive and accurate high resolution melting(HRM)technology-based assay to screen for common K-ras mutations［J］.Cell Oncol，2009，31:161－167

［18］Maria Erali，Karl V Voelkerding，Carl T Wittwer，et al.High resolution melting applications for clinical laboratory medicine［J］.Exp Mol Pathol，2008，85(1):50－58

［19］傅新晖，邓艳红，范新娟，等.利用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变［J］.中华普通外科学文献，2009，3(5):376－378

［20］高菲，师建国，魏金花燕，等.HRM法检测肺癌EGFR基因突变［J］.现代肿瘤医学，2011，19(6):1089－1092