宿根矮化病菌对甘蔗茎细胞超微结构的影响

陈明辉 ，谢晓娜 ，杨丽涛，2，李杨瑞，2

(1 广西大学 农学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530005;2 中国农业科学院甘蔗研究中心，农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007)

甘蔗宿根矮化病(Ratoon stunting disease，RSD)是世界植蔗地区一种普遍发生的种苗传播病害［1］.该病于1944年在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种Q28上被首次发现［2］.我国大陆于1986年首次报道该病害［3］，随后广东、福建、广西、云南对蔗区进行普查，结果表明均存在甘蔗RSD［4-7］.该病是由一种寄居维管束木质部的棒状杆菌属细菌Leifsonia xyli subsp.xyli(Lxx)引起的，该种细菌较难进行人工培养［8-9］.蔗株感染RSD 病菌后，表现为蔗株矮化、蔗茎变细(尤其是宿根蔗)、宿根分蘖率降低，且蔗株矮化会随甘蔗宿根年限延长而加重［10］.由于RSD 病原菌侵染蔗株后没有典型外部症状，通过观察蔗株症状诊断该病害相当困难［11］，虽然RSD 病原细菌的PCR 检测技术已非常成熟［12］，但应用于田间的大批量检测还存在很多困难;再加上RSD 病原细菌特别小，难以分离、培养和去除［13］，从而使得该病害经种茎进行无意识的传播，病害蔓延，对甘蔗产量和品质影响极大.一般情况下蔗区感染该病害产量下降5%，遇到干旱的环境条件，产量下降达50%［14］.本文以感染RSD 病菌后的甘蔗茎维管束导管细胞和健康植株茎维管束导管细胞为研究材料，应用组织超薄切片技术，从亚细胞水平揭示RSD 病原菌侵染甘蔗后，茎维管束导管细胞的超微病变规律，为进一步研究RSD病原菌与甘蔗寄主互作关系及生产上防治RSD 病害提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

2009年12月从广西大学农学院甘蔗试验田采集甘蔗品种ROC22 生长后期(300 d)疑似RSD 病症的植株和从广西农业科学院组培中心隔离温室中采集甘蔗品种ROC22 生长后期(300 d)健康脱毒苗植株作为试验材料.取其基部2～3 节，经过PCR 检测［15］，确定采集的病症植株感染了RSD 病原菌，健康脱毒苗植株没有感染RSD 病原菌.以健康甘蔗品种ROC22 为对照，感染RSD 甘蔗品种ROC22 为处理，取其茎基部2～3 节为试验样品材料，每个处理重复3 次.

1.2 方法

将采集的茎节间样品去皮后，用小刀切成长(3～5)mm×(1～2)mm 的小块.样品材料用φ 为2.5%的戊二醛预固定，0.2 mol·L-1的磷酸缓冲液(pH 6.8)冲洗2 次，再用ρ 为10 g·L-1的四氧化锇固定，经常规方法乙醇、丙酮脱水，醋酸铀染色、渗透后，用Eopon 树脂包埋.包埋材料在德国产Reichert-Jung ULTR ACUTE 型超薄切片机上切片，超薄切片在日本产日立H-7250 透射电镜下观察并拍照.

2 结果与分析

2.1 茎细胞内部的变化

与健康植株茎细胞相比较，感染RSD 的甘蔗茎细胞内部发生了明显的病理变化.健康甘蔗植株的茎细胞排列整齐，细胞内没有填充物质(图1A).而在感染了RSD 病菌的甘蔗茎维管束导管细胞中，细胞内积累有大量的、分布不均的电子致密物质(图1B、1C、1D、1E、1F).

图1 感染RSD 甘蔗植株茎维管束导管细胞内部超微结构变化Fig.1 Ultrastructural alteration inside the vessel cells in vascular bundles of sugarcane stalks infected by RSD

2.2 茎细胞壁的变化

与健康植株相比，感染RSD 病原菌的甘蔗茎细胞壁发生了较大的变化.健康植株茎细胞排列整齐，细胞壁厚薄均匀，结合紧密(图2A).感染RSD 病原菌的甘蔗茎细胞壁有的表面附着一层胶黏物质(图1D、1E 和图2B、2C、2D).而有的细胞壁粗细不均，排列松散，局部变形断裂，被分解成细胞壁碎屑和纤维丝(图1B、1C、1D 和图2D、2E、2F).

图2 感染RSD 甘蔗植株茎维管束导管细胞壁超微结构的变化Fig.2 Ultrastructural alteration in cell wall of vessel cells in vascular bundles of sugarcane stalks infected by RSD

3 讨论与结论

RSD 侵染甘蔗植株后，主要集中在其基部茎2～3 节间处.甘蔗维管束导管是运输营养物质和水分的主要通道.由于RSD 病原菌的侵染，甘蔗茎维管束导管细胞遭到破坏，势必会影响到甘蔗植株的正常生长，从而影响到糖分积累和甘蔗产量.本研究通过电镜超薄切片观察发现，感染RSD 病原菌的茎维管束导管细胞内出现了电子密度大的物质，这与Gillaspie等［16］报道的结果一致.这种物质可能与甘蔗茎维管束导管细胞抵抗、减少或延迟RSD 病原菌侵染的一种抗性机制有关.这些物质可能是RSD 病原菌诱导产生的酚类或酶类物质，但还需要进一步研究证实.

Montero-Vitorello 等［17］研究发现，在Lxx 的基因中存在基因岛，这些基因岛包含可能的假基因，能够产生果胶酶和纤维素酶的同系物，这些物质都和细胞壁的降解有关，这可能是Lxx 从甘蔗中吸取营养的一条途径，并且它们可能触发寄主的防御;Kao等［18］研究也曾指出，感染宿根矮化病甘蔗植株的矮化症状和较弱的宿根能力是导管被堵塞的结果;这些是根据Lxx 的基因特性推断的结果，没有解剖学上的证据.本研究通过超薄切片结构观察，发现RSD病原菌侵染甘蔗后，果胶酶和纤维素酶首先降解细胞壁中胶层，然后逐渐降解细胞壁，细胞壁被分解，产生大量的碎屑和纤维丝，使寄主维管束导管细胞的纹孔膜堵塞，导致甘蔗茎维管束导管对营养物质和水分的运输能力降低，造成甘蔗植株生长缓慢，植株矮小;有的感病植株茎维管束导管细胞壁增厚，细胞壁附着胶黏物质，堵塞导管，这从解剖学方面为Lxx 的致病性提供了证据.这些胶黏物质是由Lxx 产生的一些物质引起的，还是甘蔗的自身防御机制，或者二者皆有，有待进一步研究.

综上所述，本研究从解剖学角度证明了在RSD胁迫下，感染RSD 的甘蔗植株导管细胞壁厚薄不均，局部变形断裂，被分解成细胞壁碎屑，细胞内积累有大量的电子致密物质.这可能是造成甘蔗植株生长缓慢，植株矮化的原因.

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