姜黄素对人鼻咽癌株CNE-2Z细胞凋亡的影响及机制研究

王桂秋

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高 发恶性肿瘤之一，生长位置深，并有重要血管神经相邻，不易发现且不易手术切除［1-2］。临床上多采用放射治疗作为NPC首选治疗方案，但因其具有中度敏感性、较高分化、预后差及易复发等特点，临床上也多采用外科切除和药物干预等方法进行治疗［3］。姜黄素(Curcumin，CU)是一种从姜黄根茎(Curcuma L.)中提取的活性成分，具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗发炎、降血脂［4］作用。其中，姜黄素抑制肿瘤的作用已由众多实验中得到证实，同时其抗癌机制已成为国内外研究的热点［5-8］。本试验拟采用体外人鼻咽癌株 CNE-2Z细胞模型，探讨CU对CNE-2Z中内源性PI3K/Akt通路的影响，为阐明其对NPC的诱导凋亡作用机制提供科学的理论依据。

1 实验材料

1.1 细胞 人鼻咽癌母系细胞株CNE-2Z细胞购自中国医学科学院肿瘤细胞库。

1.2 药物与试剂 姜黄素(纯度＞96%):Sigma公司。DMEM培养基:Gibco公司。小牛血清:Hyclone公司。胰蛋白酶:Sigma公司。0.25%胰酶:Gibco公司。8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)ELISA试剂盒:武汉博士德公司。甲基偶氮唑盐(MTT):Sigma公司。二甲基亚砜(DMSO):Sigma公司。荧光染料hoechest33342:Biotium公司。PI3K和Akt抗体:武汉博士德公司。蛋白裂解液:武汉博士德公司。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)一抗、二抗:Sigma公司。

1.3 仪器 ZHJH-C1214C垂直流超净工作台(杭州汇尔仪器设备有限公司)。CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)。IX71-A21PH倒置显微镜(日本Olympus公司)。JC303A-T电热恒温培养箱(成都一恒科技有限公司)。GelDoc XR+凝胶成像系统(美国Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 将胰酶用D-Hank's液配成0.05%的浓度，并置于37℃水浴中孵化。用10 mL含20%血清的培养液重悬CNE-2Z细胞，接种于60 cm2的培养瓶中，放置在培养箱中2 h后，取出，将未贴壁的细胞悬液取出，台盼蓝拒染法计数后，加入培养液调整细胞浓度为5×105个/mL，接种到目的培养器皿中。接种后24 h，用温的培养基轻轻冲洗培养的CNE-2Z细胞1次，除去未贴壁的细胞，再更换培养液继续培养孵化。

2.2 分组及给药 孵化使细胞贴壁后，用含10%小牛血清的DMEM培养基稀释成不同浓度的CU终浓度(0、20、40、80 μmol/L)，每孔 100 μL，同时设3个平行孔/组。重复实验5次，获取平均值数据。应用Graphpad Prism软件计算IC50(半数抑制率)，即CU干预 CNE-2Z细胞24、48 h后的 IC50值。同时增设对照组。

细胞增殖抑制率 =(OD对照-OD治疗)/(OD对照-OD空白)×100%

2.3 指标检测 MTT法检测其对CNE-2Z抑制增殖的作用，ELISA法检测8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)水平，Hoechst33342染色检测细胞形态学的变化，Western blotting法检测PI3K和Akt磷酸化水平。所有实验步骤均严格按照供应商说明书进行操作。

2.4 统计学方法 采用SPSS 13.0软件，数据以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CU干预对CNE-2Z细胞抑制作用 MTT法数据表明，梯度浓度的CU对CNE-2Z细胞增殖的抑制作用逐渐增加，与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。实验结果同时提示，CU对CNE-2Z的干预有明显的剂量和时间依赖关系。见表1。

表1 梯度浓度的CU对CNE-2Z细胞抑制作用(n=10)

3.2 CU干预对CNE-2Z细胞8-OHdG水平的影响

ELISA结果显示，与空白对照组比较，CU干预组CNE-2Z细胞中8-OHdG表达逐渐增多，差异有统计学意义(P＜0.01)。其中，高剂量CU组表现出明显的促进8-OHdG表达的效果，体现出一定的剂量依赖关系。见图1。

3.3 CU干预对CNE-2Z细胞凋亡形态变化的影响 Hoechst33342染色结果显示，空白对照组中CNE-2Z的细胞核呈现为均匀弥散的淡蓝色荧光，核饱满，胞浆丰富。20 μg/mL浓度CU干预48 h后，开始有部分CNE-2Z细胞核出现碎裂，蓝色荧光加强并出现细胞密度减少。40/80 μg/mL浓度CU干预后，CNE-2Z细胞分散，并造成核裂解和染色质聚集，呈现致密较强蓝色荧光，并伴随着凋亡细胞计数的增多。见图2。

图1 CU干预对CNE-2Z细胞内源性8-OHdG表达的影响(±s，n=10)

图2 CU干预对CNE-2Z细胞凋亡的影响(Hoechst33342染色，×200)

3.4 CU干预对CNE-2Z细胞p-PI3K和p-Akt表达的影响 Western blotting分析表明，空白对照组中p-PI3K和p-Akt磷酸化程度较高，处于过激活状态。经CU干预48 h后，CNE-2Z细胞中p-PI3K和p-Akt表达水平显著下调，表现出一定的剂量和时间依赖性，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。见图3。

图3 CU干预对CNE-2Z细胞内源性8-OHdG磷酸化水平的影响(±s，n=10)

4 讨论

鼻咽癌是我国南方各省份地区常见的恶性肿瘤，在医学技术迅猛发展的今天，其发病率却一直居高不下。而且鼻咽癌易扩散、转移，具有较高的隐蔽性，使得病情诊断存在一定的困难［9-10］。放射治疗一直是鼻咽癌的基本治疗方法。因鼻咽癌常有局部组织浸润或颅底骨质破坏，手术常不能彻底清除病灶。早中期鼻咽癌的5年生存率平均在80%左右，而晚期仅为20% ～30%。因此，开发有效的治疗手段可以最大程度地降低患者的痛苦和社会的负担，而中药活性成分的发掘就成为抗癌治疗的潜在策略［11］。在本研究中，MTT实验结果显示，CNE-2Z细胞未受药物干预时不受控制的增殖趋势，提示抑制癌细胞的增殖可以有助于控制癌症病情。CU干预有效地抑制了CNE-2Z的增殖，初步说明CU具有抑制CNE-2Z细胞增殖作用。细胞DNA发生损伤时，脱氧鸟苷C-8位点受氧化应激作用8-羟基-脱氧鸟苷(8-OHdG)，造成体循环中8-OHdG浓度异常升高［12］。故检测细胞群中的8-OHdG代谢水平，可以间接反映癌细胞增殖状况。本实验中CU显著增加8-OHdG的表达水平，提示CU抗细胞增殖作用与诱导CNE-2Z细胞发生氧化破坏 DNA双链有关。同时，Hoechst33342染色观察到，CU干预的CNE-2Z细胞明显发生了细胞核病变，进一步说明了CU诱导CNE-2Z细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

有研究结果表明，PI3K/Akt通路活性介导下游靶基因/蛋白的表达，进而启动一系列复杂的细胞级联反应，调控着细胞的增殖、分化、生长和凋亡的病理生理过程［13-15］。此外，PI3K/Akt通路的激活与癌症发生发展密切相关［16-17］，研究发现，癌细胞通过增强PI3K与Akt的磷酸化活性，调控细胞周期蛋白的表达，下调肿瘤坏死因子(TNF)的基因转录，促进细胞不断地增殖和生长［18-19］。因此，抑制癌细胞中的PI3K和Ak磷酸化水平是治疗癌症的积极策略［20-21］。本研究中，Western blotting结果表明，CNE-2Z细胞中 p-PI3K、p-Akt表达明显增多，处于激活状态。经CU干预后，CNE-2Z细胞中高表达的PI3K和Akt磷酸化水平被有效抑制，提示抑制内源性PI3K/Akt通路是CU抗肿瘤的作用机制之一。

综上所述，姜黄素具有抑制CNE-2Z细胞增殖的作用，将为其今后在临床中的应用提供有效的基础理论依据。但姜黄素是否能有效合理地应用于鼻咽癌患者的临床治疗还需要进一步的研究。

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