NF-κB 抑制剂 PDTC对大肠癌体外血管生成因子表达的影响

潘 娟，曲延刚，刘 毅

(湖北省恩施州中心医院1.病理诊断中心;2.妇产科，湖北恩施445000)

核转录因子-κB(nuclear transcription factor κB，NF-κB)信号通路属于转录因子家族成员。在静止细胞中，NF-κB 与其抑制性分子 IκB(α/β/ε)形成稳定的复合物存在于细胞质。当受到某些因子刺激后，复合物中的IκBα在IκB激酶IKK的作用下磷酸化，脱下IκBα的NF-κB转移到细胞核，进而激活它们的下游靶基因，发挥生物学作用［1］。NF-κB信号通路在炎性反应、感染、肿瘤及淋巴细胞生成中都扮演着重要角色［2］。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)是广为人知的 NF-κB依赖性血管生成相关因子，它们在肿瘤细胞内表达的高低反映肿瘤细胞潜在的血管生成能力［3－6］。PDTC(pyrrolydine dithiocarbamate)作为 NF-κB 活性抑制剂，它能够通过抑制 NF-κB的活性，促进ARPE-19细胞中炎性调节因子的表达［7］;打击人胰腺癌的血管生成潜能［4］。在人大肠癌中，抑制NF-κB的活性是否也可以降低血管生成因子VEGF和b-FGF的表达，进而影响大肠癌的体外血管生成能力?目前尚无文献报道。本研究拟观察NF-κB抑制剂PDTC对人大肠癌Lovo细胞系体外促HUVEC血管生成能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人大肠癌Lovo细胞系和人脐静脉内皮细胞(重庆医科大学汤唯学教授惠赠)，PDTC(碧云天公司)，鼠抗人NF-κB抗体、兔抗人b-FGF抗体和兔抗人 β-actin抗体(Santa Cruz公司)，鼠抗人p-IκBα 抗体(Cell Signaling公司)，兔抗人VEGF抗体(博士德生物工程有限公司)，辣根酶标记山羊抗兔、抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术公司)，24 Well Transwell Permeable Supports(Millipore公司)，Matrigel(BD 公司)，CCK-8试剂盒(Dojindo公司)。

1.2 NF-κB抑制剂PDTC处理Lovo细胞

实验组PDTC按照终浓度5 mmol/L加入到Lovo细胞培养瓶中培养1 h。未作处理Lovo细胞为对照组［8］。

1.3 Western blot

分别收集处于对数生长期的各组Lovo细胞养至1.0×106个/mL。蛋白提取液分别提取各组细胞蛋白，操作按试剂盒说明书进行。Bradford法(考马斯亮蓝法)测定各组蛋白浓度，8%SDS-PAGE凝胶电泳，转膜并封闭非特异性结合位点之后，分别用抗NF-κB、p-IκBα、VEGF、b-FGF 和 β-actin 的一抗孵育(抗体稀释浓度分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000和1∶500)，4 ℃ 冰箱过夜，辣根酶标记的二抗孵育2 h，ECL试剂检测膜上的免疫反应条带，凝胶成像仪下观察并进行分析。以对照组Lovo细胞各种待检蛋白分别与β-actin吸光度的相对比值计算，每项检测重复6次(n=6)。

1.4 HUVEC体外迁移能力检测

采用Transwell小室体外细胞迁移实验，参照Sanda等［9］的方法稍加修改。将处于对数生长期的各组Lovo细胞分别种植到24孔板，1.0×105个/孔，含10%胎牛血清RPMI1640培养基加入下室补齐2.0×10－4L/孔，37 ℃、5%CO2培养箱中常规培育1 d，次日将处于对数生长期的HUVEC种植到小室，1.0×105个/Transwell小室，加 DMEM 培养液入小室内补齐1×10－4L/孔，再将小室分别置于24孔板上同两组Lovo细胞共培养，8 h后PBS液清洗，棉签擦去内室细胞，95%乙醇固定15 min，HE染色，应用倒置显微镜观察HUVEC迁移情况并计数(高倍镜400倍下随机选取5个视野)。

细胞迁移抑制率=(对照组平均迁移细胞数－实验组平均迁移细胞数)/对照组平均迁移细胞数×100%。

1.5 HUVEC增殖活性检测

采用 CCK-8细胞增殖检测实验，参照 Yang等［10］的方法稍加修改。取各组Lovo细胞2×106个分别加入到0.1 L培养瓶，加含10%胎牛血清的RPMI1640培养基至每瓶总体积2×10－3L，37℃、5%CO2常规培养各组Lovo细胞，48 h后收集各组上清液。将处于对数生长期的HUVEC种植入96孔板，2×103个/孔，加含10%胎牛血清的DMEM培养液补齐1×10－4L/孔，37 ℃、5%CO2培养箱中常规培育1 d，次日吸净培养液，分别向孔内加入不同组别Lovo上清液2×10－5L，再向孔内加入含10%胎牛血清的DMEM培养液各8×10－5L使每孔总体积仍为1×10－4L，设3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中常规培育72 h后加 CCK-8试剂1×10－5L/孔，37℃、5%CO2培养箱中常规孵育4 h后测450 nm处A值。

细胞增殖抑制率=(对照组平均A值－实验组平均A值)/对照组平均A值×100%。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组 Lovo 细胞 NF-κB、p-IκBα、VEGF 和b-FGF的蛋白表达

实验组细胞内 NF-κB、p-IκBα、VEGF 和b-FGF蛋白表达量显著低于对照组 (P＜0.05)(图1，表1)。

2.2 PDTC对HUVEC体外迁移能力的影响

实验组HUVEC的迁移数量为65±3，显著低于对照组128±4(P＜0.05)(图2)。PDTC对HUVEC的迁移抑制率为49.2%。

2.3 PDTC对HUVEC体外增殖能力的影响

实验组HUVEC的增殖数量为0.514±0.056(以450 nm处测得的A值表示)，显著低于对照组的1.915±0.121(P＜0.05)。PDTC对HUVEC的增殖抑制率为73.2%。

图1 各组Lovo细胞NF-κB、p-IκBα、VEGF和b-FGF蛋白表达情况Fig 1 Expressions of NF-κB，p-IκBα，VEGF and b-FGF protein in each groups Lovo cells

表1 各组 Lovo细胞 NF-κB、p-IκBα、VEGF和 b-FGF表达量Table 1 Expressions of NF-κB，p-IκBα，VEGF and b-FGF in each groups Lovo cells(x±s，n=6)

图2 各组HUVEC的迁移能力Fig 2 The migration of HUVEC in each groups(×400)

3 讨论

NF-κB是转录因子家族成员之一，这个家族共有5个成员，它们通过不同组合形成二聚体，存在于细胞质。当受到某些因子刺激后，NF-κB转移到细胞核，发挥生物学作用，NF-κB活化一个不可或缺的环节就是IκBα 的磷酸化和 NF-κB 入核［1］。本研究通过测定胞质 p-IκBα和胞核 NF-κB的表达，其结果显示PDTC处理细胞后胞质p-IκBα和胞核NF-κB的表达都明显降低，说明PDTC在作用Lovo细胞1 h后成功抑制了NF-κB活性。

VEGF和b-FGF为NF-κB依赖性促血管生成因子，它们受 NF-κB 的调节［3-6］。本研究结果显示，实验组VEGF和b-FGF的表达较对照组明显降低，说明在人大肠癌Lovo细胞中NF-κB活性受到抑制后，其血管生成相关因子VEGF和b-FGF表达是降低的，它们受到NF-κB的正向调节。同时有文献报道，在培养的骨肉瘤细胞、人神经母细胞瘤细胞的上清液中有 VEGF 存在［11－12］，VEGF 以分泌形式发挥其侵袭和促血管生成作用。在培养的肥胖症患者脂母细胞的上清液中也有VEGF存在，其可能在肥胖相关的2型糖尿病中起着促炎作用［13］。b-FGF也可以分泌形式促进角膜损伤细胞修复［14］，导致猪心肌缺血再灌注损伤模型的骨髓间充质干细胞向血管分化［15］。基于 VEGF和 b-FGF都属于可分泌蛋白［11－15］，本研究收集各组 Lovo细胞的上清液分别培养 HUVEC，并采用 CCK-8细胞增殖实验检测HUVEC增殖能力，结果显示，实验组HUVEC的增殖能力明显降低。同时本研究采用Transwell细胞迁移实验检测HUVEC的迁移能力，结果显示，实验组HUVEC的迁移能力亦明显减弱。因此认为，Lovo细胞内NF-κB活性的抑制可以降低HUVEC体外促血管生成能力，其可能是通过降低细胞内促血管生成因子VEGF、b-FGF等的表达，进而减少它们的分泌来实现的。

综上所述，本研究结果显示，在人大肠癌Lovo细胞中，NF-κB抑制剂PDTC作用1h后能显著抑制NF-κB的活性;PDTC能降低促血管生成因子VEGF、b-FGF等的表达;PDTC能抑制HUVEC体外促血管生成能力，这可能与VEGF、b-FGF等的分泌减少有关，其详尽机制尚需进一步探讨。

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