温阳通脉方对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响及其信号传导途径

李彬彬，石月萍

辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州 121001

心肌梗死是严重危害人类健康的主要疾病之一。随着急诊溶栓、经皮冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等再灌注治疗方法的推广，可有效恢复缺血心肌的血供和营养支持。但再灌注治疗在恢复心肌血供的同时也带来心肌的缺血-再灌注 损 伤 (myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)。心肌缺血-再灌注损伤是缺血心肌再灌注之后一种严重的甚至致命的病理生理改变，所导致的心肌细胞死亡以往多认为是坏死，但近年来大量研究表明，细胞凋亡也是参与MI/RI中的重要组成部分，其发生、发展还受多种基因调控，通过干预凋亡相关基因蛋白的表达来抑制细胞凋亡，可减轻MI/RI，达到保护心肌的目的[1-5]。古今大量临床实践已证实中医药能够有效治疗冠心病。因此，探索中医药防治心肌细胞凋亡成为防治冠心病新的着眼点。本实验研究中药温阳通脉方对大鼠心肌缺血-再灌注的影响，探讨其心肌保护机制。

材料和方法

1 动物 体质量250~300 g健康雄性SD大鼠36只，随机分为3组，每组12只，购于辽宁医学院实验动物中心。

2 药品、试剂及仪器 温阳通脉方中药免煎剂：人参、三七、桂枝、枳实、瓜蒌、薤白等，订购于华润三九医药股份有限公司(生产批号：1101082S)；蛋白激酶b试剂盒，订购于北京中杉金桥试剂有限公司；凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，订购于南京凯基公司。MCE-1000心电监护仪(深圳辽瑞生物医疗电子股份有限公司)；DH-150型动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂)；HC-3018高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；数码照像机；全自动生化检测仪(日本日立7170A)。

3 分组及给药 IR组：0.9%氯化钠注射液灌胃(每只2 ml)2周后穿线结扎大鼠冠状动脉左前降支，缺血30 min后松开结扎线，使之再灌注120 min；WTF组：中药免煎剂用0.9%氯化钠注射液稀释到合适比例灌胃2周，后穿线结扎大鼠冠状动脉左前降支，缺血30 min后松开结扎线，使之再灌注120 min；WTF+BA组：中药免煎剂用0.9%氯化钠注射液稀释到合适比例灌胃2周，后穿线结扎大鼠冠状动脉左前降支，缺血30 min后经尾静脉注射阻滞剂LY294002后松开结扎线，使之再灌注120 min。

4 大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)再灌注模型的建立 大鼠用20%乌拉坦0.5 ml/kg行腹腔麻醉后于动物手术台固定，取颈正中切口，分离颈总动脉备实验过程中动脉插管取血，气管插管进行机械通气(呼吸频率：60/min；潮气量：10~15 ml；呼吸比1∶3)；于胸骨左旁第2~3肋间行纵行切口，分离胸大肌及肋间肌，结扎肋间动静脉，剪断肋骨，破胸膜、心包膜，暴露心脏；在左心耳下缘与肺动脉圆锥间左冠状动脉前降支起始部使用带6.0Prolene线的缝合针，自左心室侧穿入，由肺动脉圆锥侧穿出，留线暂不结扎，待血压、呼吸稳定10~15 min后再收紧结扎线，结扎之前在预结扎的冠状动脉左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)处放置一根约0.5 cm长直径1.5 mm的乳胶管；供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫，心电图示ST段弓背向上抬高＞0.5 mV，局部心肌变成紫红色并有节段性运动不良，证实闭塞有效。缺血30 min后剪断结扎线，使冠状动脉再通，形成再灌注状态，松开结扎线前后ST-T峰值下降50%以上，局部心肌变红，为AMI再灌注模型成功，再灌注120 min后处死动物。

5 心肌梗死范围测定 再灌注120 min后处死动物立即取出心脏，用0.9%氯化钠注射液冲洗后吸干水分，留取左心室及室间隔，自心尖到心室基底部将心肌横切成厚2 mm左右的组织片，放入氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)的溶液(0.5 g/L)中，在37 ℃恒温水浴中染色15 min后取出冲净拭干，梗死区心肌未着色，非梗死区呈紫蓝色，计算梗死区重量占整个左心室重量的百分数，作为心肌梗死范围的测定。

6 细胞凋亡率检测 再灌注120 min麻醉经颈动脉取血后，取出心脏，将缺血区心肌组织(左心室前壁中间段)剪下，10%中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧尿甘缺口末端标记法，按照试剂盒说明进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。每张切片于凋亡细胞分布区域各取5个高倍视野，计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数(%)表示凋亡指数(apoptotic index，AI)。

7 Western blot测 Akt、p-Akt蛋白表达 取 -80 ℃深低温保存的心肌组织约100 mg，加入1 ml细胞裂解液，匀浆破碎，4 ℃离心15 000 r/min 30 min取上清，BCA法测定蛋白质含量，制成含蛋白量相等的样品。行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。然后将蛋白电转到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS中封闭，加入一抗，4 ℃封闭过夜；第二日，TBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下摇床上孵育1 h；按Western blot发光试剂盒说明书显影，用Bio Rad密度扫描仪进行扫描，测定各蛋白的相对光密度值。

8 统计学处理 采用SPSS13.0软件统计分析所得数据，所有数据均以表示，两组间比较采用两样本均数的t检验，多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 温阳通脉方对心肌梗死面积的影响 NBT染色法显示3组大鼠均有梗死心肌，但WTF组较IR组以及WTF+BA组梗死心肌的重量以及梗死心肌重量占左心室重量的百分比明显减少(见表1)。

2 温阳通脉方对心肌细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示3组均可见凋亡的阳性细胞，但WTF组较IR组以及WTF+BA组心肌凋亡细胞数量以及心肌细胞凋亡指数(AI)值明显减少，3组大鼠的心肌细胞凋亡指数(AI)值比较(见表1)，3组大鼠的TUNEL染色结果(见图1)。

3 温阳通脉方对PI3K-Akt信号传导途径的影响WTF组较IR组及WTF+BA组P-Akt的表达明显增加；WTF组较IR组及WTF+BA组总Akt的RD无明显差别；WTF组较IR组及WTF+BA组的P-Akt的RD明显增加。3组大鼠的Akt和p-Akt的表达情况(见图2)，3组大鼠的p-Akt的表达比较及Akt和p-Akt的RD值比较(见表2)。

讨 论

温阳通脉方具有温阳化痰活血的功效，经多年年临床实践观察验证为治疗冠心病不稳定性心绞痛的有效方剂[6]。本实验通过对心肌梗死范围的测定发现，WTF组的心肌梗死面积明显小于IR组及WTF+BA组，表明温阳通脉方能够减少大鼠心肌再灌注损伤模型的心肌梗死面积，具有心肌保护作用。有研究表明，氧化应激、钙超载、内皮功能紊乱以及细胞凋亡等均参与了心肌缺血-再灌注损伤，细胞凋亡是再灌注损伤发病机制的一个重要环节[7-9]。本实验使用TUNEL法发现WTF组的细胞凋亡数明显低于对照组，表明温阳通脉方在一定程度上可能减少大鼠心肌细胞凋亡。

再灌注损伤抢救激酶途径(reperfusion injury salvage kinase，RISK)的激活是缺血-再灌注损伤的主要保护机制之一。目前发现RISK途径主要包括磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt和细胞外信号调节激酶(p42/p44extra-cellular signal-regulated kinases，ERK1/2)两条通路。PI3K-Akt是细胞内重要的信号传导通路，在细胞凋亡、存活，以及增殖等活动中发挥重要的生物学功能。近年来大量实验证实，缺血预适应和后适应对心肌的保护作用与PI3K-Akt的激活有关，从而抑制心肌细胞凋亡与坏死[10-13]。本实验研究发现，温阳通脉方组P-Akt的蛋白表达较IR组及温阳通脉方+阻滞剂组均明显增加，证实了温阳通脉方可能是通过激活PI3-Akt途径，减少了心肌细胞凋亡，从而达到心肌保护作用。

综上所述，温阳通脉方具有心肌保护作用，能够减少心肌细胞凋亡，其作用的机制可能与PI3K-Akt激酶途径激活有关。大量实验及临床研究也表明中药在改善血流动力学、保护血管内皮功能、降低缺血再灌注损伤、改善心肌代谢等方面具有保护作用且多层次、多靶点调理内环境，效果显著[14-16]。在中医理论指导下，结合现代实验方法，研究温阳通脉方对缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨其机制，对运用中药防治冠心病，开发临床减轻心肌缺血-再灌注损伤有效方剂，具有重要的科学意义及广阔的应用前景。

图1 3组大鼠的TUNEL染色结果(×400)Fig.1 TUNEL staining of tissue from IR group(A), WTF group(B), and WTF+BA group (C) (×400)

图2 IR组(A)，WTF组(B)，WTF+BA组(C)P-Akt，Akt的表达Fig.2 Expression of P-Akt and Akt in IR group (A), WTF group(B)and WTF+BA group(C)

表1 三组心肌梗死面积及细胞凋亡指数(AI)比较Tab.1 Myocardial infarction size and AI in 3 groups

表2 三组p-Akt以及Akt和p-Akt的RD值比较Tab.2 RD for p-Akt, Akt and p-Akt in 3 groups

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