人星状病毒Ⅰ型衣壳蛋白序列分析

牛 科，单 思，巴彩凤

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

星状病毒(astroviruses)是一种主要引起人和动物以腹泻症状为主的急性病毒性胃肠炎的单股正链RNA病毒[1]。人星状病毒(human astroviruses，HAstV)主要感染5岁以下婴幼儿、免疫抑制人群及老年人。1975年，Appleton和Higgins电镜检测儿童腹泻粪便标本时发现HAstV。其基因全长6.4~7.3 kb，包括5'端非编码区和3'端的polyA结构，基因组中含三个ORF1a、ORF1b和ORF2开放阅读框。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，ORF2编码结构蛋白-衣壳蛋白(capsid protein)。因ORF2区是变异相对较高的区域，通过对ORF2的5'端基因序列分析将HAstV分为8个传统的血清型(HAstV1-8)[2]。另外，美国学者利用宏基因组技术分离到HAstVMLB型、 VA型、 HMOASTV型3种新的病毒亚型[3-7]。本实验应用生物信息软件及互联网在线数据分析工具对HAstV1衣壳蛋白序列进行分析，预测其二级结构、三级结构等空间结构和分子质量、理论等电点、消光系数、半衰期、不稳定系数、脂肪系数等理化参数及亲水性、柔韧性、抗原指数及表面可及性等生物学特性，为进一步完善星状病毒基础研究和临床研究资料提供科学数据。

材料和方法

1 基因序列 HAstV1衣壳蛋白GeneBank序列号：L23513，因特网(Internet)链接网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L23513。

2 蛋白理化参数分析 通过ExPASy数据库中的ProtParam软件分析HAstV1衣壳蛋白的分子质量、理论等电点、氨基酸组成、半衰期、不稳定系数、脂肪系数、总平均疏水性。

3 二级结构预测与生物学特性分析 通过DNAStar软件程序中的Editseq软件将HAstV1衣壳蛋白中的基因序列翻译成氨基酸序列，与GeneBank中的氨基酸序列校对，通过Protean模块分析和预测蛋白的二级结构及其生物学特性。链接网址：http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input。应用immune epitope软件中Kolaskar-Tongaonkar法预测HAstV1衣壳蛋白平均抗原指数。

4 三级结构预测 通过在线数据分析工具Swiss-Model Workspace蛋白分析软件预测HAstV1衣壳蛋白的三级结构。然后，应用Swiss-pdb Wiewer软件模拟蛋白的3D结构。

结 果

1 HAstV1衣壳蛋白氨基酸序列 翻译后的氨基酸序列与GeneBank中一致。序列如下：MASKSNKQVTVEVSNNGRNRSKSRARSQSRGRDKSV KITVNSRNRARRQPGRDKRQSSQRVRNIVNKQLRKQ GVTGPKPAICQRATATLGTVGSNTSGTTEIEACILLNP VLVKDATGSTQFGPVQALGAQYSMWKLKYLNVKLT SMVGASAVNGTVLRVSLNPTSTPSSTSWSGLGARKH LDVTVGKNATFKLKPSDLGGPRDGWWLTNTNDNAS DTLGPSIEIHTLGRTMSSYKNEQFTGGLFLVELASEW CFTGYAANPNLVNLVKSTDNQVPVTFEGSAGSPLIMN VSEGSHFARTVLARSTTPTTLARAGERTTSDTVWQV LNTAVSAAELVTPPPFNWLVKGGWWFVKLIAGRTR TGSRSFYVYPSYQDALSNKPALCTGSTPGGMRTRNP VTTTLQFTQMNQPSLGHGEAPAAIGRSIPAPGEEYKV VLTFGSPMSPNANNKQTWVNKPLDAPSGHYNVKIAK DVDHYLTMQGFTSIASVDWYTIDFQPSEAPAPIKGLQ VLVNISKKADVYAVKQFVTAQTNNKHQVTSLFLVKV TTGFQVNNYLSYFYRASATGDATTNLLVRGDTYTAG ISFTQGGWYLLTNTSIVDGAMPPGWVWNNVELKTNT AYHMDKGLVHLIMPLPESTQMCYEMLTSIPRSRASG HGYESDNIEYLDAPDSADQFKEDIETDTDIESTEDED DEADRFDIIDTSDEEDGNETDRVTLLSTLVNQGMTMT RATRIARRAFPTLSDRIKRGVYMDLLVSGVSPGNAW SHACEEARKAVGETNPCTSGSRGHAE。

2 理化参数分析 通过ProtParam软件分析，HAstV1衣壳蛋白序列编码787个氨基酸；分子质量为85 772.2；理论等电点为9.00；在构成HAstV1衣壳蛋白的20种氨基酸中，苏氨酸(Thr)和甘氨酸(Gly)占的比例最高，分别为10.3%和7.9%，其含72个负电荷氨基酸(AsP+Glu)， 82个正电荷氨基酸(Arg+Lys)；HAstV1衣壳蛋白的半衰期哺乳动物网组系统-体外为30 h，酵母-体内＞20 h，大肠杆菌-体内＞10 h；且其不稳定系数为38.50，属于稳定性蛋白；脂肪系数为71.86；总平均疏水性为-0.435。

3 二级结构预测与生物学特性分析 利用DNAStar-Protean软件分析得到HAstV1衣壳蛋白具有规则的二级结构，含有较多的α螺旋和β折叠等稳定结构，及丰富的β转角和无规卷曲等韧性结构，且亲水性区段、柔韧性区段、抗原指数较高及表面可及性大的区段分布亦较多(图1)。通过immune epitope软件中Kolaskar-Tongaonkar法预测HAstV1衣壳蛋白平均抗原指数为1.013，最大值为1.194，最小值为0.848，见图2。

4 三级结构预测 Swiss-Model Workspace应用PDB序列号3qsq为模板预测HAstV1衣壳蛋白的三级结构(图3)；并采用Swiss-pdbViewer蛋白质分析软件模拟HAstV1衣壳蛋白的分子表面模型(图4)。由图可知，HAstV1衣壳蛋白由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等结构组成规则的空间构象。该构象有7个由疏水氨基酸构成的α-螺旋区域，位于蛋白的内部；以8个疏水性残基为主的β-折叠处于蛋白的中心，两者共同构成一个疏水核心区域；β-转角和无规则卷曲等柔韧性结构位于蛋白的外部，它们结构比较松散，易扭曲变形。

图2 HAstV1衣壳蛋白的抗原表位指数分析Fig.2 Antigenic epitope index for HAstV1 capsid protein

图3 HAstV1衣壳蛋白的三级结构Fig.3 Tertiary structure of HAstV1 capsid protein

图4 HAstV1衣壳蛋白分子表面模型Fig.4 Molecule surface of HAstV1 capsid protein

讨 论

随着信息时代的到来，生物信息学得到发展和广泛应用。通过计算机软件模拟和程序预测出各种核酸和蛋白质的结构、理化参数及生物学特性等信息或提供与之相关的辅助信息，从而用较低的成本和较快的时间获得可靠的结果，大大的提高了实验效率[8]。

本研究应用生物信息学理论分析HAstv1衣壳蛋白的理化参数与分子生物学特征发现，HAstv1衣壳蛋白是结构较稳定蛋白且具有很好的抗原性，可以作为免疫用抗原，对进一步研究HAstV1检测方法、病毒侵袭力、毒力以及病毒起源都具有非常重要的意义。该蛋白是研究HAstv1抗原性、生化特性、结构功能的理想工具，可应用于HAstv1的免疫诊断和疫苗研制中。

1 Strain E， Kelley LA， Schultz-Cherry S， et al. Genomic analysis of closely related astroviruses［J］. J Virol， 2008， 82（10）： 5099-5103.

2 王永霞，段招军，李宇宁．人星状病毒研究进展［J］.病毒学报，2012，28（4）：482-487．

3 Finkbeiner SR， Holtz LR， Jiang Y， et al. Human stool contains a previously unrecognized diversity of novel astroviruses［J］. Virol J，2009， 6：161.

4 Finkbeiner SR， Li Y， Ruone S， et al. Identification of a novel astrovirus （astrovirus VA1） associated with an outbreak of acute gastroenteritis［J］. J Virol， 2009， 83（20）： 10836-10839.

5 De Benedictis P， Schultz-Cherry S， Burnham A， et al. Astrovirus infections in humans and animals - molecular biology， genetic diversity， and interspecies transmissions［J］. Infect Genet Evol，2011， 11（7）： 1529-1544.

6 Kapoor A， Li L， Victoria J， et al. Multiple novel astrovirus species in human stool［J］. J Gen Virol， 2009， 90（Pt 12）： 2965-2972.

7 Jeong AY， Jeong HS， Jo MY， et al. Molecular epidemiology and genetic diversity of human astrovirus in South Korea from 2002 to 2007［J］. Clin Microbiol Infect， 2011， 17（3）： 404-408.

8 Rubinstein ND， Mayrose I， Halperin D， et al. Computational characterization of B-cell epitopes［J］. Mol Immunol， 2008， 45（12）：3477-3489.