低氧浓度与常规氧浓度对胚胎早期发育及妊娠结局的影响

牛子儒，马慜悦，岳晓静，张士慧，陆翀曌，王 辉，舒军萍，彭红梅，姚元庆

解放军总医院 妇产科生殖中心，北京 100853

随着辅助生育技术的发展，多种胚胎培养系统正在临床应用，其中培养箱氧气浓度在各个中心应用有所不同。一些研究显示在小鼠，牛和猪等哺乳动物的胚胎培养中，降低培养箱内混合气体的氧气浓度对胚胎发育有一定好处[1-8]。在一些哺乳动物中已经观察到子宫内的氧浓度低于输卵管内的氧浓度。恒河猴输卵管内的氧浓度是5%~8.7%，而在其子宫内的氧浓度只有约2%[9]。因此，可以认为当胚胎到达子宫时是暴露于一个低氧的环境，同时这也是囊胚形成和植入的时段。有研究指出人类胚胎体外培养在3~5 d时降低氧浓度与在1~5 d时降低氧浓度可以提高相似的卵裂率和妊娠率，提示低氧浓度对8细胞期囊胚更为重要，并与有关子宫内氧浓度较输卵管内低的研究相一致[9-10]。在人类辅助生殖周期中，传统胚胎培养箱采用大气中的氧浓度(约20%)，有研究提出过高的氧浓度可能产生对胚胎有害的物质如氧自由基[11-12]。但有关人类胚胎培养氧浓度影响的研究结果并不一致。有些研究显示降低氧浓度(5%)未能显著提高胚胎的质量、着床率和妊娠率。但也有研究显示低氧浓度可以提高临床妊娠率和出生率[13-17]。本研究通过评估常规氧浓度(20%)与低氧浓度(5%)对人类胚胎在受精后第1天到第3天的影响，比较两组胚胎发育和妊娠情况。

资料和方法

1 对象 经患者知情同意后，收集本中心2012年3-11月接受体外受精(in vitro fertiliza-tion，IVF)或卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的周期病例。获得的受精卵分配到常规氧浓度(20%)或低氧浓度(5%)两个培养箱中。ICSI主要应用在男性因素所致的不孕(精子密度＜3×106/ml，畸形率＞95%及a+b级精子活力＜50%)和前次IVF受精率低或自然受精障碍的周期。其他周期采用常规IVF方案。排除行附睾/睾丸穿刺活检-单精子授精(PESA/TESA)及胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)等的周期病例。

2 周期方案 所有周期均根据患者反应情况采用本中心常规超促排卵方案，GnRH激动剂与促性腺素 (human menopausal gonadotropin，HMG)相结合刺激卵泡发育。超声监测卵泡生长情况，并与激素测定相结合确定取卵时机，给予5 000 IU人绒毛膜促性腺素促排，肌注36 h后阴道超声引导下取卵，约5 h后进行人工授精或单精子注射。在第3天根据胚胎发育情况、形态、患者年龄、取卵数及其他情况确定是否新鲜移植及移植胚胎数目。对剩余形态学评分较高的胚胎冷冻保存。解冻移植的周期根据其自身情况采用自然或人工周期，同样移植2个或3个解冻胚胎。根据胚胎透明带厚度和患者年龄等情况决定是否进行辅助孵化。

3 胚胎培养 卵子和胚胎在覆盖矿物油(Vitrolife Ovoil)的50 μl和20 μl的培养液(Vitrolife G系列)小滴中培养。采用Therom公司的培养箱，常规氧浓度组(20%)采用5%的二氧化碳和空气进行氧浓度控制；低氧浓度组(5%)采用5%的二氧化碳、90%的氮气和空气进行氧浓度的控制。每天对两个培养箱的气体浓度进行监测并在必要时校正。在受精18~20 h后，以是否出现原核来判断卵子的受精情况[18]。

4 胚胎形态学评分 在受精后第2、3天，根据每一个胚胎的卵裂球数目、大小和碎片等情况进行形态学评分。Ⅰ级，胚胎卵裂球均匀规则，胞质均质透明，透明带完整，胚胎无或仅有极少(＜5%)碎片；Ⅱ级，卵裂球形态轻度不均匀，胞浆折光性有轻微变化，碎片＜10%，透明带完整；Ⅲ级，胚胎内碎片＜20%，其余卵裂球形态同Ⅱ级，透明带完整；Ⅳ级，胚胎内碎片＞20%，碎片外卵裂球具有活细胞特征，胞浆折光性有较大改变，胞浆变黑、颗粒不均匀[19]。

5 评价指标 1)胚胎发育情况：包括正常受精率(正常受精数目/MⅡ数目)，多精受精率(多精受精数目/MⅡ数目)，卵裂率(卵裂数目/受精数目)，优质胚胎率(胚胎评分1或2的数目/所有胚胎数目)；2)妊娠结局包括：生化妊娠率和临床妊娠率。

6 统计学分析 采用SPSS13.0对数据进行统计分析，采用两独立样本的t检验及χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 两组患者基本情况比较Tab.1 Basic parameters of patients in two groups

表2 两组胚胎发育与妊娠结局比较Tab.2 Embryo development and pregnancy outcome in two groups(%)

结 果

1 一般资料 共195例周期进入研究，低氧浓度组为101例周期，常规氧浓度组为94例周期。两组间一般特征如男女方年龄、不孕年限、IVF/ICSI方案、获卵数及周期移植胚胎数等资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2 不同氧浓度对胚胎发育及妊娠结局的影响 两组多精受精率，D1卵裂率，D2、D3优胚率比较均无统计学差异(P＞0.05)。两组新鲜移植率，胚胎冷冻率，解冻移植率比较均无统计学差异(P＞0.05)。两组新鲜移植周期妊娠率，低氧浓度组高于正常氧浓度组(χ2=3.963，P＜0.05)。解冻移植周期妊娠率无统计学差异(P＞0.05)。见表2。

讨 论

本研究评价了在胚胎培养混合气体中降低氧浓度对胚胎发育和IVF/ICSI结局的影响，遗憾的是与常规氧浓度相比，未发现低氧浓度对胚胎质量、早期发育等有明显益处。但在新鲜移植周期的妊娠率比较中，低氧浓度组的妊娠率高于正常氧浓度组，可以认为经低氧浓度培养的胚胎更利于着床。但解冻周期的胚胎移植妊娠结局未发现两组有明显差异。

体内胚胎一直暴露于低氧环境中，从未暴露于20%的氧浓度环境，而这一氧环境被很多学者认为可以产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS包括超氧阴离子基团(O2-)，过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH)[9,12]。过高的ROS可以导致DNA损伤、线粒体改变、脂质过氧化或蛋白质的氧化改变等[11-12,20]。有研究显示高氧环境可以改变胚胎的发育潜能[21]。在一些动物研究中发现了高氧环境的不利影响，如在大鼠试验中，低氧与高氧培养的胚胎桑葚胚和囊胚的发生率及形态学虽然无差异，但低氧培养的胚胎内细胞团数目和着床率显著高于正常氧浓度组[2]。胚胎早期接触高氧浓度的危害可能并不直接表现，而是体现在发育后期，从而影响妊娠。最近Nannasy等报道，将胚胎在第1、2天时用20%氧浓度培养，第3~5天时改用5%氧浓度培养，与一直用20%氧浓度组相比，其种植、妊娠或囊胚形成率并未提高。这可能是由于在3-5天时改用低氧浓度培养，并不能改善早期高氧浓度对其造成的损害[22]。

目前胚胎培养系统中混合气体的氧浓度尚未得到一致定论。有关氧浓度对胚胎发育影响的研究存在很大争议。Dumoulin等报告低氧与正常氧浓度对胚胎发育和妊娠率的影响无显著差异，但在延长培养的胚胎中发现低氧浓度可以显著提高囊胚形成率和囊胚细胞的数量[14]。Bahceci等发现低氧环境第3天的胚胎评分显著高于正常氧浓度，但临床结局无显著差异[15]。Kea等的研究也发现了相似的结果[16]。Meintjes等发现低氧与正常氧的种植率和妊娠率无显著差异，但囊胚形成率低氧组高于常规氧浓度组[23]。亦有研究显示低氧可以提高着床与妊娠率[20]。这些研究的结果差异较大，也有可能是由于培养液不同，移植期不同或样本量不足等造成的。此外，不同人群基线人口学特征也可能导致这一差异。因此还应综合其他因素来比较这些研究结果。

2011年Gomes Sobrinho等的Meta分析共纳入了7个相关研究，其对胚胎受精率、妊娠结局分析指出，目前还没有证据证明低氧浓度是必须的，虽然有一些关于低氧浓度培养有益的报道，但得出低氧浓度有助于IVF结局的结论还为时尚早，仍需要进一步的随机对照试验来证明[24]。2012年来自Cochrane协作网的Bontekoe等人的系统综述同样纳入了7个研究，通过分析显示低氧浓度可以提高IVF的出生率，但其纳入的研究方法学质量较低，仍需更多高质量的研究来证实[25]。目前这些研究都只关注于形态学和着床情况，今后的研究可以更多关注其他的潜能指标，比如氧浓度导致基因表达的改变[26]。培养小鼠胚胎在Whitten培养液时基因H19的缺失低于在KSOM+AA培养液[27]。另一研究中显示，在培养液中加入血清可以影响印记基因的表达[28]。这些为将来的氧浓度研究提供了一些可以考虑的检验指标。

综上所述，本研究显示在低氧浓度中培养胚胎可以提高新鲜移植周期的妊娠率，但并未显著提高胚胎发育和FET结果。这可能是由于样本量不足，也可能是由于低氧浓度并不一定对胚胎培养有所改善，亦有可能是低氧浓度仅对3~5 d的囊胚期胚胎发育有所帮助。总之，需要包含更多观察因素、客观指标及大样本的随机对照研究来发现其差异，客观说明氧浓度对胚胎发育的影响。

1 Eppig JJ， Wigglesworth K. Factors affecting the developmental competence of mouse oocytes grown in vitro： Oxygen concentration［J］. Mol Reprod Dev， 1995， 42（4）： 447-456.

2 Karagenc L， Sertkaya Z， Ciray N， et al. Impact of Oxygen concentration on embryonic development of mouse zygotes［J］.Reprod Biomed Online， 2004， 9（4）： 409-417.

3 Rinaudo PF， Giritharan G， Talbi S， et al. Effects of Oxygen tension on gene expression in preimplantation mouse embryos［J］. Fertil Steril， 2006， 86（4 Suppl）： 1252-1265.

4 Fukui Y， Mcgowan LT， James RW， et al. Factors affecting the in-vitro development to blastocysts of bovine oocytes matured and fertilized in vitro［J］. J Reprod Fertil， 1991， 92（1）： 125-131.

5 Soom AV， Yuan YQ， Peelman LJ， et al. Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different Oxygen tensions with or without cysteine addition［J］.Theriogenology， 2002， 57（5）： 1453-1465.

6 Balasubramanian S， Son WJ， Kumar BM， et al. Expression pattern of Oxygen and stress-responsive gene transcripts at various developmental stages of in vitro and in vivo preimplantation bovine embryos［J］. Theriogenology， 2007， 68（2）： 265-275.

7 Kitagawa Y， Suzuki K， Yoneda A， et al. Effects of Oxygen concentration and antioxidants on the in vitro developmental ability， production of reactive Oxygen species （ROS）， and DNA fragmentation in porcine embryos［J］. Theriogenology， 2004， 62（7）：1186-1197.

8 Booth PJ， Holm P， Callesen H. The effect of Oxygen tension on porcine embryonic development is dependent on embryo type［J］.Theriogenology， 2005， 63（7）： 2040-2052.

9 Fischer B， Bavister BD. Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesus monkeys， hamsters and rabbits［J］. J Reprod Fertil， 1993，99（2）： 673-679.

10 Kim SB， Kwon H， Kim EK， et al. The comparison of embryo developments and pregnancy rates in human in vitro culture conditions at different Oxygen gas phase［J］. Fertil Steril， 2005， 84（Suppl 1）：S16.

11 Johnson MH， Nasr-Esfahani MH. Radical solutions and cultural problems： could free Oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryos in vitro?［J］.Bioessays， 1994， 16（1）： 31-38.

12 Guérin P， El Mouatassim S， Ménézo Y. Oxidative stress and protection against reactive Oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings［J］. Hum Reprod Update， 2001， 7（2）：175-189.

13 Dumoulin JC， Vanvuchelen RC， Land JA， et al. Effect of Oxygen concentration on in vitro fertilization and embryo culture in the human and the mouse［J］. Fertil Steril， 1995， 63（1）： 115-119.

14 Dumoulin JC， Meijers CJ， Bras M， et al. Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo culture［J］.Hum Reprod， 1999， 14（2）：465-469.

15 Bahçeci M， Ciray HN， Karagenc L， et al. Effect of oxygen concentration during the incubation of embryos of women undergoing ICSI and embryo transfer： a prospective randomized study［J］.Reprod Biomed Online， 2005， 11（4）：438-443.

16 Kea B， Gebhardt J， Watt J， et al. Effect of reduced Oxygen concentrations on the outcome of in vitro fertilization［J］. Fertil Steril， 2007， 87（1）： 213-216.

17 Kovacic B， Vlaisavljević V. Influence of atmospheric versus reduced Oxygen concentration on development of human blastocysts in vitro：a prospective study on sibling oocytes［J］. Reprod Biomed Online，2008， 17（2）： 229-236.

18 Steer CV， Mills CL， Tan SL， et al. The cumulative embryo score：a predictive embryo scoring technique to select the optimal number of embryos to transfer in an in-vitro fertilization and embryo transfer programme［J］. Hum Reprod， 1992， 7（1）： 117-119.

19 Brinsden PR. Textbook Of In Vitro Fertilization And Assisted Reproduction： The Bourn Hall Guide To Clinical And Laboratory Practice［M］. Taylor & Francis，2005：287-308.

20 Catt JW， Henman M. Toxic effects of Oxygen on human embryo development［J］. Hum Reprod， 2000， 15 Suppl 2（suppl 2）：199-206.

21 Bavister B. Oxygen concentration and preimplantation development［J］. Reprod Biomed Online， 2004， 9（5）： 484-486.

22 Nanassy L， Peterson CA， Wilcox AL， et al. Comparison of 5% and ambient Oxygen during days 3-5 of in vitro culture of human embryos［J］. Fertil Steril， 2010， 93（2）： 579-585.

23 Meintjes M， Hill K， Johnston S， et al. The effect of lowered incubator Oxygen tension on implantation-， pregnancy- and cryopreservation rates in a predominantly Day-5 embryo transfer program［J］. Fertil Steril， 2000， 74（Suppl 1）： S511

24 Gomes Sobrinho DB， Oliveira JB， Petersen CG， et al. IVF/ICSI outcomes after culture of human embryos at low oxygen tension： a meta-analysis［J］. Reprod Biol Endocrinol， 2011， 9 ：143.

25 Bontekoe S， Mantikou E， Van Wely M， et al. Low oxygen concentrations for embryo culture in assisted reproductive technologies［J］. Cochrane Database Syst Rev， 2012， 7 ：CD008950.

26 Lonergan P， Fair T， Corcoran D， et al. Effect of culture environment on gene expression and developmental characteristics in IVF-derived embryos［J］. Theriogenology， 2006， 65（1）： 137-152.

27 Doherty AS， Mann MR， Tremblay KD， et al. Differential effects of culture on imprinted H19 expression in the preimplantation mouse embryo［J］. Biol Reprod， 2000， 62（6）：1526-1535.

28 Fernández-Gonzalez R， Moreira P， Bilbao A， et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes， development， and behavior［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 2004， 101（16）： 5880-5885.