七氟烷预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注时HO-1表达的影响

贺建东 韩冲芳 董玥颖 雒珉 王晓鹏

心肌缺血再灌注损伤常在进行冠状动脉旁路移植术、急性心肌梗死溶栓术及CPB下心内直视手术等治疗时发生。研究表明，七氟烷预处理、后处理及两者联合处理均可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，具体机制尚未完全阐明[1-3]。研究表明，血红素氧合酶-1（HO-1）基因转染可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[4]。本研究拟评价七氟烷预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注时HO-1表达的影响，为明确七氟烷的心肌保护作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠40只（山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（晋）2009-0001），体重250～280 g。仪器：七氟烷挥发罐（aeommedvp 3000），ALC-V 8动物呼吸机（上海奥尔特生物科技有限公司），麻醉气体监护仪（vamos,德国Draeger Medical AG&Co.KgaA）。

1.2 主要药品和试剂 (1)主要药品：七氟烷（sevoflurane，批号：9520，丸石制药株式会社）；(2)试剂：CK-MB试剂盒（上海罗氏公司），HO-1兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司bs-0827 R)，PV-6001二步法免疫组化检测试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 模型制备 实验前动物禁食8 h，自由饮水，10%水合氯醛0.3 mL/kg行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，针状电极连续监测标准肢体导联心电图。颈部正中切口，分离气管，气管切开，连接动物呼吸机行机械通气，呼吸频率60次/min，潮气量6～7 mL，吸∶呼=1∶2，吸入纯氧，氧流量为1 L/min，麻醉气体监护仪与气管导管连接，用于监测呼气末七氟烷浓度，七氟烷挥发罐与动物呼吸机进气端连接，用于调节吸入七氟烷的浓度。在左侧胸壁胸骨左缘0.5 cm处第3、4肋间打开胸腔，剪开心包，暴露心脏。用6-0丝线在左心耳根部与肺动脉圆锥之间穿过左冠状动脉前降支（LAD），丝线两端穿聚乙烯小管(直径0.1 cm，长0.5 cm)，拉紧细线，用止血钳夹闭小管，即可阻断LAD，心电图示ST段抬高，T波高耸，结扎线下心肌组织发绀并活动减弱，说明心肌缺血模型成功。30 min后松开止血钳，使LAD恢复血流，ST段下降，发绀区逐渐变红示心肌再灌注成功。结扎前出现心电图不正常或未到观察终点而死亡的大鼠排除本研究。

1.4 动物分组 实验动物随机分为5组（n=8）：假手术组（S组）、心肌缺血再灌注组（I/R组）、七氟烷预处理组（S-Pre组）、七氟烷后处理组（S-Post组）、七氟烷预处理联合后处理组（S-Pre+S-Post组）。除S组外均采用结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注模型，S组只穿线，不结扎；S-Pre组缺血前30 min吸入1 MAC的七氟烷15 min，洗脱15 min；S-Post组再灌注前10 min吸入1MAC的七氟烷15min；S-Pre+S-Post组缺血前30 min吸入1MAC的七氟烷15 min，洗脱15 min，再灌注前10 min吸入1 MAC的七氟烷15 min。

1.5 血清CK-MB水平测定 于实验结束时迅速腹主动脉取血2 mL，离心后按试剂盒说明在日立7600型全自动生化分析仪上测定CK-MB含量。

1.6 心肌梗死面积测定 再灌注结束后原位结扎冠状动脉，经主动脉逆行灌注1%的Evans蓝2～3 mL，待非缺血区心肌充分染成蓝色后摘取心脏，剪除大血管、心房及右心室，置于-20℃冰箱中20 min，从心尖向心底部将左室切成厚2～3 mm的切片，置入0.5%氯化硝基四氮唑蓝磷酸缓冲液中（pH=7.4），37℃水浴18 min，冷生理盐水冲洗染料，10%甲醛溶液固定。染成蓝色的区域代表非缺血区，红色区域（含白色区）代表缺血区（AAR），白色区域代表坏死区（AN），沿不同颜色的边缘切下不同区域并称重，心肌梗死面积以坏死区心肌重量/缺血区心肌重量(AN/AAR)来表示。

1.7 心肌组织病理变化和HO-1蛋白表达测定 再灌注120 min后剪下心肌组织，迅速分离出左心室，置于4%中性甲醛固定24 h后，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下（×100）观察各组心肌病理学变化。免疫组织化学方法测HO-1蛋白表达，切片按照PV-6001二步法免疫组化说明书进行。光镜下（×400）观察，阳性反应为胞浆呈棕黄色，每张切片随机选取5个视野，利用BI-2000医学图像分析系统分析阳性区域平均光密度值（optical density,OD），以OD值代表HO-1蛋白阳性产物的表达。

1.8 统计学方法 所有数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，数据进行正态性检验，组间进行单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与S组比较，其余4组血清CK-MB水平增高，心肌梗死面积增加，心肌组织HO-1表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与I/R组比较，S-Pre组、S-Post组和S-Pre+S-Post组血清CK-MB水平降低，心肌梗死面积减小，心肌组织HO-1表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与S-Pre组和S-Post组比较，S-Pre+S-Post组血清CK-MB水平降低，心肌梗死面积减小，心肌组织HO-1表达增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组血清CK-MB水平、心肌梗死面积和心肌HO-1含量比较(±s,n=8）

表1 各组血清CK-MB水平、心肌梗死面积和心肌HO-1含量比较(±s,n=8）

注：与S组比较，aP＜0.05与I/R组比较，bP＜0.05与S-Pre组和S-Post组比较，cP＜0.05

S组 8 187.32±55.19 0 0.12±0.03 IR组 8 2587.02±512.66a 30.56±2.12a 0.25±0.05a S-Pre组 8 1856.84±421.78ab 16.61±1.64ab 0.37±0.07ab S-Post组 8 1771.43±328.95ab 15.67±1.55ab 0.40±0.10ab S-Pre+S-Post组 8 1038.56±317.08abc 10.86±1.43abc 0.54±0.11abc

光镜下观察心肌组织病理变化。S组心肌纤维排列整齐，细胞形态正常，间质无水肿，横纹排列整齐。I/R组心肌纤维排列紊乱，细胞肿胀，间质水肿明显，胞浆染色变浅，细胞间边界模糊，大部分横纹消失。S-Pre组和S-Post组心肌病理变化基本相同，介于I/R组和S-Pre+S-Post组间，S-Pre+S-Post组心肌纤维排列基本整齐，细胞轻度水肿，部分间质水肿轻度增宽。

3 讨论

本实验参照文献[3]采用结扎左冠状动脉前降支30 min，再灌注120 min的方法制备大鼠心肌缺血再灌注模型。结果表明，与S组比较I/R组大鼠血清CK-MB水平增高，心肌梗死面积增加，心肌组织HO-1表达增高，结合心电图和病理学结果，说明模型制备成功。

CK-MB是心肌细胞所特有的，具有高度的敏感性和特异性，因此CK-MB可作为判断心肌细胞损伤程度的敏感指标[5]。本实验采用血清中的CK-MB的浓度来判断心肌损伤的情况。本研究中，七氟烷预处理、七氟烷后处理及二者联合处理都能明显降低血浆CK-MB水平，心肌细胞变性坏死减轻，对缺血再灌注心肌起到保护作用，且联合处理组心肌保护作用强。心肌梗死面积是判断心肌梗死的“金标准”，其测定有助于判断心肌损伤的程度[2]。本研究中，各七氟烷处理组的心肌梗死面积较I/R组减小且联合处理组最小，说明七氟烷能有效地降低心肌细胞的损伤。

血红素氧合酶（Hemo oxygenase，HO）有3种同工酶形式，其中HO-1是一种诱生型的应激蛋白，可被多种刺激诱导而表达增高，缺血再灌注等因素诱导可显著增加酶活性，进一步促进血红素的分解代谢，发挥细胞、组织、器官的保护作用。Katori等[6]研究发现，HO-1过度表达参与大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，其作用机制与HO-1催化血红素降解产生胆绿素、CO和Fe2+有关。胆绿素与其还原产物胆红素通过清除羟基、O2、脂质过氧化物酶等保护细胞免受氧化损伤[7]，CO可反馈抑制NO大量合成，减轻氧化损伤，Fe2+可通过调节铁蛋白的合成清除体内氧自由基[8]。CO是体内重要的气体信号转导分子，与HO-1构成的HO-1/CO系统也具有很强的抗氧化作用[9]。在本实验中，与I/R组相比七氟烷各处理组心肌HO-1蛋白表达水平增加，提示七氟烷通过上调HO-1蛋白表达，来降低缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，发挥保护效应，且联合处理组心肌保护作用较强。而七氟烷是通过什么途径上调HO-1的表达而发挥其心肌保护作用还有待进一步的研究。

综上所述，与单纯七氟烷预处理或后处理比较，两者联合处理在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用要强，这种保护作用可能是通过部分上调HO-1表达来发挥抗氧化应激反应而实现的。

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[3]刘悦，任建军，刘雅，等.七氟醚预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注时血栓素A 2和前列腺素I 2的影响[J].中华麻醉学杂志，2011，31(2)：240-244.

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