T细胞斑点试验在结核病中的诊断价值

刘艳

结核是我国的重大传染病之一，也是威胁全球健康的呼吸道传染病。近年来，结核病有明显上升趋势。据世界卫生组织估计，全球目前有约20亿的人感染过结核分枝杆菌[1]。如何快速准确的诊断活动性结核患者对结核病的防控尤为重要。传统的抗酸杆菌涂片敏感性仅有50%～60%。分枝杆菌培养是目前临床上应用于结核病诊断的金标准，但其需等6～8周时间才能有结果，培养要求较高，培养阳性率偏低。目前对菌阴肺结核、儿童结核及肺外结核的诊断仍比较困难。本研究通过对49例确诊结核患者及47例非结核患者行T-SPOT.TB检查，探讨其在结核病的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料2011年3月～2012年8月我科收治菌阴结核及肺外结核（肺结核符合中华结核病诊治指南诊断标准，淋巴结结核为病理证实，结核性胸膜炎、腰椎结核、结核球为治疗随访后证实）患者49例（观察组），平均年龄（47±19）岁，其中男27例，女22例。49例结核患者中，肺结核患者42例，结核性胸膜炎3例，腰椎结核1例，淋巴结结核2例，结核球1例。对照组47例，为经相关检查及治疗后排除结核感染的患者，其中男28例，女19例，平均年龄（53±19）岁。47例患者中，其中肺炎34例，陈旧性结核2例，胸腔积液2例，腹腔积液1例，慢性支气管炎1例，发热1例，恶性肿瘤3例，慢性咳嗽1例，腮腺肿大1例，间质性肺炎1例。两组资料年龄、性别均无统计学差异。

1.2 试剂与方法 T-SPOT.TB：T-SPOT.TB试剂盒（上海复星科技有限公司提供）。肝素抗凝管采集8 mL外周静脉血，离心分离外周血单核细胞（PBMC）。于显微镜下计数细胞数，配置每100微升含有25万细胞的标准溶液。取出T-SPOT.TB试剂盒内微板孔，阴性对照加入细胞培养液，阳性对照加入植物血凝素，另外两孔分别加入抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP-10）各50 μL，然后每孔加入100 μL含有PCMC的上述细胞悬液，置于CO2培养箱37℃温度孵育16～20 h，用pH值6.8～7.2的PBS液洗脱，加入碱性磷酸酶标记的抗IFN-γ单克隆抗体50 μL，4℃孵育2 h，再用PBS液洗脱，每空加入显色液50 μL。避光室温静置7 min，蒸馏水冲洗后观察结果，用放大镜人工计数每空斑点数。阳性结果定义为：当阴性对照孔点数为0～5时，测量孔点数减去对照孔点数≥6，当阴性对照孔点数≥6时，测量孔点数≥两倍对照孔点数[2]。

结核菌素试验（PPD）：PPD（结核菌素纯蛋白衍生物，四川成都生物技术公司生产，50 U/mL），以5 U注入左前臂内侧上中1/3交界处皮内，使之形成皮丘，48～72 h观察反应，结果判断以局部硬结直径为依据，＜5 mm为阴性，5～9 mm为一般阳性反应，10～19 mm为中度阳性反应，≥20 mm或不足20 mm但有水疱或坏死为强阳性反应[3]。

结核抗体：采用胶体金标法，按试剂说明书操作。结核抗体检测试剂由MP生物医学亚太私人有限公司提供。

1.3 统计学方法 应用SPSS 12.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组中47例T-SPOT.TB检测阳性，敏感性为95.9%，与PPD及结核抗体比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。对照组中，2例T-SPOT.TB阳性，特异性为95.7%，与PPD及结核抗体比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 T-SPOT.TB试剂与PPD、结核抗体结果比较[n（%）]

3 讨论

近年来，结核病的发生率呈明显上升趋势。据估计2010年，全球新增结核病例共880万例，约145万患者死于结核感染[4]。我国是世界上仅次于印度的第二个结核病高负担国家，结核感染率为44.5%，活动性结核患者450万，每年死亡人数达13万[5]。我国是全球22个结核病高负担国家之一，2000年中国第四次全国结核病流行病学调查资料[5]显示，活动性肺结核患病率为367/10万，菌阳肺结核患病率为160/10万，涂阳肺结核患病率为122/10万。而这一数据现仍呈上升趋势。

结核菌的病原学检查是诊断结核的金标准，但其受标本中细菌的数量影响大，常规培养需要时间长，且培养阳性率偏低，不利于肺结核的早期发现、诊断与治疗。PPD试验是目前筛查结核感染的主要防范，但其某些抗原成分与卡介苗及非结核性分枝杆菌抗原成分相同，易发生交叉反应，从而导致假阳性的发生，且对于老年患者、免疫抑制、重症、HIV感染及移植患者，存在假阴性[6-7]。此外，皮试操作和结果存在主观性，从而进一步降低其检查的准确性。因此寻找快速、高效诊断活动性结核病的诊断方法尤为重要。T-SPOT.TB检查是以特异性抗原为刺激源，应用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）诊断结核病的新方法，其具有较高的敏感性和特异性，且耗费时间较短，仅1 d。

Ma-hariras等[8]在1996年发现结核分枝杆菌中存在一段名为“RD 1”的基因序列。1999年，Behr等[9]应用基因芯片技术将结核分枝杆菌标准株H 37 Rv和BCG的全基因组进行比较，发现129个只存在于结核分枝杆菌而BCG缺失的开放读码框，其被划分为16个区域，后分别被命名为RD 1～RD 16，其中RD 1被证实为结核分枝杆菌所特有，在卡介苗菌株中均不存在。RD 1编码产生两种蛋白：CFP-10和ESAT-6，为结核分支杆菌特异性蛋白。结核感染人体后，体内产生特异性的记忆性T淋巴细胞，当抗原再度刺激时，其能产生特异性的细胞因子IFN-γ。Lalvani等[10]以CFP-10和ESAT-6混合抗原多肽为刺激源刺激这些记忆性T淋巴细胞，使其分泌IFN-γ，检测其细胞数，从而发现诊断结核感染的T-SPOT.TB这一新方法。

目前大量研究证实T-SPOT.TB检测对于结核感染具有较高的敏感性和特异性。Pai等[11]的meta分析提示T-SPOT.TB诊断结核病的敏感性为90%。Dai等[12]最新的meta分析提示T-SPOT.TB诊断结核病的敏感性和特异性分别为88%和89%。而在免疫抑制患者中，T-SPOT.TB同样显示出较高的敏感性和特异性。Chapman等[13]的研究显示，39例HIV阳性的结核患者中T-SPOT.TB的敏感性为90%，而PPD皮试仅为72%。Kim等[14]研究显示，72例肺外结核患者的T-SPOT.TB和PPD的敏感性分别为94%和47%，差异具有统计学意义（P＜0.001）。Liao等[15]的研究结果同样显示，T-SPOT.TB在肺外结核患者中有较高的敏感性和特异性，诊断的敏感性达到95%以上。国内霍菲菲等[16]的资料显示T-SPOT.TB在31例细菌学或组织学确诊的肺外结核患者中的敏感性为93.5%。我们的结果与国内外的报道相一致，T-SPOT.TB在诊断结核的敏感性和特异性分别为95.9%和95.7%，与PPD、结核抗体相比起具有更高的敏感性和特异性。

结核病很多没有特异性的临床表现，且PPD、结核抗体检测、抗酸杆菌涂片菌均因其敏感性和特异性不够，因此临床常对结核病出现漏诊、误诊。结核菌阳性率不高且培养时间较长，一般均在患者出院后才能出具报告，限制了其在临床上的应用。而T-SPOT.TB在诊断结核病方面有着较高的特异性和敏感性，且时间短，24 h内即可出具结果，因此在辅助结核病的诊断方面有着较高的应用价值，值得在临床上推广应用，为患者早期诊断、早期治疗提供帮助。

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