大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

王翠艳 魏芳晶 阴淑莹 李云霞 张晓云 乔晓娟 石秀换

(内蒙古医科大学附属医院保健中心一病区，内蒙古 呼和浩特 010050)

骨髓间充质干细胞(MSCs)〔1〕是从骨髓中分离培养出的一种多潜能干细胞，具有很强的自我复制和多向分化潜能，可产生具有各种表型的子代细胞，还能通过与造血细胞密切接触，分泌细胞外基质和多种细胞调节因子调节造血，并且可分泌多种生长因子和细胞因子。研究表明〔2〕，MSCs还能分化为心肌细胞，能补充丢失的心肌细胞，促进血管新生，从而修复受损心肌，改善心功能。另外，MSCs自体移植可避免免疫抑制剂的使用，同时MSCs易于外源基因的转染和表达，从而增强或调控移植后的治疗作用。因此MSCs被用作表达目的基因的细胞平台，在治疗缺血性心肌病方面备受关注。本文根据MSCs贴壁生长的特性进行分离和培养，并观察其生长形态，对其表型和生长曲线进行初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 DMEM培养基(低糖)(GibcoBRL公司)，胎牛血清(天津TBD灏洋有限公司)4%台盼蓝母液(上海亚培生物科技有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，兔抗大鼠CD34、CD44单抗(博奥森公司)，SP试剂盒 (福建迈新公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉公司)，FITC抗大鼠/小鼠CD90.1单抗(Ebioscience公司)、超净台(北京半导体设备一厂)、CO2培养箱(SNAYO公司)、倒置显微镜。

1.2 实验方法

1.2.1 MSCs分离、纯化及培养 取6 w左右体重120～150 g雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离胫骨、股骨，全骨髓培养法提取细胞，放于胎牛血清的DMEM培养基中，摇匀后放入37℃，5%CO2箱中进行培养。提取细胞3 d后首次换液，此后每隔3天换一次液。原代培养时生长较慢约14 d左右达90%融合，0.25%胰酶消化约1 min左右进行传代，首次传代后生长较快，约每7天传一次代。通过贴壁培养法和严格控制酶的量和消化时间，利用MSCs较易脱落的特点，保证MSCs在短暂的作用时间内与培养瓶底分开，从而使MSCs得到纯化。

1.2.2 绘制MSCs生长曲线 取生长良好的1、3代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×106/ml密度接种于24孔板中，每孔400μl，至于37℃，5%CO2箱中进行培养。第二天(大约30 h后)开始每隔24 h取4孔，用台盼蓝法进行读数。连续读14 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线。

1.2.3 MSCs表型分析 取第3代生长状态良好的细胞，制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，过氧化氢消除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清，加一抗(兔抗大鼠 CD44、CD34)，同时用 PBS作为一抗设置阴性对照，4℃湿盒过夜，加生物素化二抗，加 SABC，DAB显色，苏木素染色，脱水、封片、显微镜下观察。取第3代生长状态良好的细胞，制成单细胞悬液，以2×106细胞/ml，500μl分装于3支1.5 mlEP管中，其中2支加抗大鼠CD90-FITC，一支加PBS，混匀，避光孵育，加1 ml PBS混匀，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90表达。

2 结果

2.1 细胞培养 见图1初接种的细胞呈圆形，24 h时部分细胞开始贴壁，72 h时贴壁细胞明显增多，部分细胞伸出伪足呈纺锤样、长梭形，细胞核较大，呈圆形或椭圆形，核膜边界清楚。更换培养液。接种第1周内，细胞增殖缓慢，10 d后细胞增殖速度明显加快，第12～14天时细胞集落达90%融合。传代后细胞生长速度明显加快，于6～8 h开始贴壁，24 h后开始分裂，生长迅速，培养6～7 d可达90%融合。第3代以后细胞纯度较高，以梭形细胞为主，排列有一定的方向性，呈漩涡样生长，漩涡中心细胞呈多层分布，细胞界限不清。

图1 MSCs生长状态(×200)

2.2 绘制MSCs生长曲线 原代接种后的1～5 d为MSCs生长的潜伏期，此期主要为MSCs的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分裂活动不甚活跃;约7 d后，细胞生长速度开始加快;10 d后细胞生长达指数生长期;第14天达到高峰进入平台期。传代细胞的生长速度较原代快，潜伏期为24 h，3～4 d细胞生长达指数生长期;接种后7 d达到高峰，然后生长逐渐缓慢，进入平台期。见图2。

图2 MSCs生长曲线

2.3 MSCs表型特征 免疫细胞化学染色显示3代细胞CD44为阳性反应，可见细胞膜呈棕黄色着色，胞浆轻度着色;而造血干细胞和淋巴细胞的标志CD34免疫组化染色为阴性。表明MSCs有CD44抗原表达，具有间质细胞的标志。见图3。流式细胞分析法检测表面标志物显示均一的表达MSCs标志CD90，阳性99%以上。

图3 免疫组化法MSCs细胞表面标志表达(×200)

3 讨论

骨髓来源的干细胞主要包括造血干细胞〔3〕(HSCs)、MSCs和血管内皮祖细胞(EPCs)。MSCs来源于中胚层，能够支持和维持造血微环境。在调节造血干细胞的长期存活及生长分化过程中起重要作用，且能够分化成多种中胚层来源的间叶组织细胞。最早在1867年Cobnhein首次提出骨髓具有造血以外的功能，直到1968年才被在实验中发现和命名。1997年Asahara T等在体外成功的分离培养出MSCs。MSCs的突出特点是具有自我更新和多向分化潜能。在不同的诱导条件下可以向不同的胚系分化，而且可以跨胚层分化〔4〕。

目前已经建立了多种体外分离、纯化、培养MSCs的方法:①贴壁筛选法，②密度梯度离心法，③流式细胞仪分选法，④免疫磁珠法。本实验采用的是贴壁筛选法，将骨髓细胞直接进行贴壁培养，通过反复、多次换液去除未贴壁的造血干细胞，获得贴壁生长的MSCs，用L-DMEM+15%FBS作为基本培养基，通过换液、传代进行纯化和扩增培养。文献报道〔5〕体外培养的MSCs，在形态上呈纺锤形成纤维细胞状，能附着在塑料或玻璃培养皿上生长，形成均匀的集落或贴壁的融合层，而无明显的接触抑制。本研究也证实了上述观察结果。从细胞生长曲线上可以看出，无论原代培养还是传代培养，各代细胞均具有明显的潜伏期、对数增长期和平台期，具有常规细胞体外培养的特点。MSCs是一群具有独特表型及细胞化学特征的处于未分化状态的非定向干细胞〔6〕，MSCs可以表达细胞因子(IL-1a、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、SCF、LIF、M-CSF 等);细胞因子受体(IL-1R、IL-3R、IL-7R、G-CSFR、PDGFR 等);MSC 的表型不均一，具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点，即MSCs可以表达多种黏附相关分子，如整合素亚基a3、a4、a5、β以及整合素 avβ3、avβ5、ICAM-1、CD44H 等。它对表面抗原 SB-10、SH-2、SH-3、SH-4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、和 CD124等均呈阳性反应，而对造血细胞的CD14、CD34、CD45抗原均呈阴性反应。本实验观察了MSCs细胞3种表面分子抗原的表达显示:CD44，CD90阳性而CD34阴性，均符合已有证实的结果。

综上，本研究建立了采用贴壁筛选法体外分离纯化MSCs方法分离纯化所得的MSCs纯度高，具有干细胞特征，适用于基因治疗和细胞治疗，为下一步研究奠定基础。

1 Jain M，Pfister O，Roger J，et al.Mesenchymal stem cells in the infarcted heart〔J〕.Coronary Artery Dis，2005;16(2):93-7.

2 Herzog EL，Chai L，Krause DS，et al.Plasticity of marrow-derived stem cells〔J〕.Blood，2003;102(10):3483-93.

3 范阜东，王东进.骨髓干细胞移植治疗缺血性心脏病的现状与前景〔J〕.心血管病学进展，2008;29(5):778-81.

4 Lorena Zentilin，Sabrina Tafuro，Serena Zacchigna，et al.Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF-induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels〔J〕.Blood，2006;107(9):3546-54.

5 华 平，陈 炬，张惠忠，等.血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植于梗死心肌的实验研究〔J〕.中华显微外科杂志，2006;29(5):947-51.

6 Gao F，He T，Wang H，et al.A promising strategy for the treatmen to fischemic heart disease:mesenchymal stem cell-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in rats〔J〕.Can JCardiol，2007;23:891-8.