河南汉族原发性高血压患者MTHFR基因C677T多态性位点检测

姚 蕊 张会敏 张俊蕾 李冬贝 范阳阳

(新乡医学院护理学院，河南 新乡 453003)

近年来，同型半胱氨酸(Hcy)已被证实是心脑血管疾病的独立危险因子，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是 Hcy代谢的关键酶之一，该基因C677T位点突变与各种心脑血管疾病的关系的研究较多，但存在分歧〔1～4〕，而与原发性高血压(EH)的关系研究尚不多见。本研究采用病例对照研究的方法，收集(EH)患者150例和与之年龄及性别匹配的对照150例，对MTHFR基因C677T多态性进行检测，探讨二者的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2008年10月至2010年10月在新乡医学院第一附属医院住院150例EH患者作为病例组，选取年龄、性别相匹配的150例同期住院患其他疾病患者或体检中心健康志愿者作为对照组。病例组患者均符合WHO关于EH的诊断标准，即收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg，年龄52～78岁，平均年龄(63.4±6.32)岁，男87例，女63例。排除继发性高血压、心脏病、糖尿病、肾脏病等患者。对照组年龄51～81岁，男85例，女65例。两组在性别、年龄、收入、吸烟、饮酒等方面匹配，没有统计学差异(P＜0.05)。

1.2 方法

1.2.1 一般资料问卷调查 采用自编问卷，调查两组性别、年龄、收入、吸烟、饮酒等一般情况。

1.2.2 一般生化指标、叶酸和同型半胱氨酸的检测 采用全自动生物化学分析仪测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FPG)数值。采用化学发光法测定也叶酸水平。应用高效液相色谱(HPLC)法测定血液中Hcy:采用Agilent1100液相色谱仪，色谱柱为 Hypersil C18柱(46 mm，250 mm，5 m);流动相为0.04 mol/L醋酸缓冲液，流速0.8 ml/min;进样量20μl;柱温25℃;分析时间15 min;荧光检测条件:激发波长382 nm，发射波长470 nm。样本两次测定值误差不超过15%。Hcy正常值设定在＜10 mol/L，超过10 mol/L定义为高同型半胱氨酸血症(HHcy)〔2〕。

1.2.3 DNA的提取和浓度测定 抽取每名患者空腹外周静脉血4 ml于EDTA抗凝管中，存放于－20℃冰箱中。集中提取DNA。用人全血DNA提取试剂盒(购于德国BMS公司)提取DNA后，存放于－20℃ 。用核酸蛋白浓度测定仪测定抽提基因组DNA浓度，并将保存的基因组模板DNA原液用 DNA溶解液稀释(GEN TRA公司Puregene试剂盒)至终浓度为5～10 ng/μl。

1.2.4 MTHFR基因型测定 采用聚合酶链式反应限制性酶切片段长度多态性分析法，扩增引物序列如下:上游 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3'和下游5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系25μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200μmol/L、正反引物各0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5μg。PCR扩增条件如下:94 ℃5 min，94 ℃30 s，56 ℃40 s，72 ℃ 40 s，35 个循环，末次延伸7 min;取8μl PCR反应产物，加4 U限制性内切酶 HinfⅠ，反应体积20μl，酶切4 h。取8μl酶切产物，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，溴乙啶(EB)染色30 min，UVP凝胶成像系统摄像判断基因型。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料进行非配对t检验及方差分析，计数资料和Hardy-Weinberg平衡检验均采用χ2检验。

2 结果

2.1 两组生化指标、叶酸、Hcy水平比较 两组血糖、血脂相比，没有统计学差异(P＞0.05)病例组叶酸水平低于对照组(P＜0.05)，病例组Hcy水平明显高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 两组血糖、血脂水平比较(x±s)

2.2 病例组和对照组MTHFR基因型和等位基因频率比较由图1可见，PCR扩增产物片段为246 bp，HinfⅠ酶切结果显示MTHFR基因型有3种，分别为野生型(C/C)、杂合子型(C/T)、纯合子突变型(T/T)，包含C等位基因的246 bp的片段不被HinfⅠ酶切，含T等位基因的片段被HinfⅠ酶切为174 bp和72 bp的两个片段。病例组MTHFR(C677T)基因CC基因型频率分别为21.3%、CT基因型频率为46.0%、TT基因型频率为32.7%，T等位基因频率为55.7%，C等位基因频率为44.3%;对照组MTHFR(C677T)基因CC基因型频率分别为40.7%、CT基因型频率为44.7%、TT基因型频率14.6%，T等位基因频率为37.0%，C等位基因频率为63.0%。见表2。

图1 PCR-RFLP电泳结果

表2 病例组和对照组MTHFR(C677T)基因型和等位基因频率〔n(%)〕

3 讨论

高血压分为EH和继发性高血压，在大多数患者中，高血压的病因不明，称为EH，占高血压总数的95%以上。关于高血压发病机制的研究主要从环境和遗传两个方面，有研究表明MTHFR基因C677T多态性与高血压关系密切〔4，5〕，并且与血浆中Hcy水平关系密切，但因为不同种族、不同地区高血压的发病率也有明显的差异，且河南豫北地区高血压的发病较高，且没有其与MTHFR基因C677T多态性的研究，因此我们从一般资料进行问卷调查，并进行生化指标的检测，发现EH与血糖、血脂水平无关，而与Hcy水平关系密切，病例组Hcy平均水平明显高于对照组，且叶酸水平明显低于对照组。我们的研究结果支持Hcy是心血管疾病的独立危险因素的传统观点，Hcy代谢过程中有一个关键酶就是MTHFR，因此越来越多的人开始关注Hcy水平与MTHFR基因多态性的关系，且大多集中在C677T位点，但研究结果并不一致，有研究表明该位点突变可引起Hcy水平升高〔6〕，国外的研究也有相同的观点。这与国外研究结果一致〔7〕，但也有报道认为 Hcy水平与 MTHFR基因C667T多态性无相关性〔8〕。本研究结果显示，病例组T等位基因和T/T型分布频率均高于对照组，提示C677T突变与河南豫北地区汉族人群EH发生有着密切关系，可能是其发病的遗传危险因素之一。

1 Sacoo RL，Adams R，Albers G，et al.Guidelines for prevention of stroke in patients with ischemic stroke or transient ischemic attack:a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association Council on Stroke:cosponsored by the Council on Cardiovascular Radiology and Intervention:the American Academy of Neurology affirms the value of this guideline〔J〕.Stroke，2006;37(2):577-617.

2 Trabetti E.Homocysteine，MTHFR gene polymorphisms，and cardio cerebrovascular risk〔J〕.JAppl Genet，2008;49(3):267-82.

3 Nahar，Akash Sabo，Cynthia CPNP，et al.Plasma homocysteine levels，methylene tetrahydrofolate reductase polymorphisms，and the risk of thromboembolism in children〔J〕.J Pediatric Hematol Oncol，2011;33(5):330-3.

4 王 红，武贵臻，张 颖，等.新疆哈萨克族人群同型半胱氨酸及其代谢酶基因多态性与原发性高血压的关系〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2010;14(33):6247-52.

5 宗永华，李小鹰，陈光亮，等.同型半胱氨酸水平与N5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的关系〔J〕.临床心血管病杂志，2011;27(3):203-7.

6 宗永华，徐希平，霍 勇，等.影响安庆农村地区H型高血压发生的遗传和环境因素〔J〕.中华高血压杂志，2011;19(5):445-9.

7 Gueantrodriguez RM，Juilliere Y，Candito M，et al.Association of MTRR A66G polymorphism(but not of MTHFR C677T and A1298C，MTR A2756G，TCN C776G)with homocysteine and coronary artery disease in the French population〔J〕.Thromb Haemost，2005;94(3):510-5.

8 Muniz MT，Siqueira ER，Fonseca RA，et al.Evaluation of MTHFR c677t gene polymorphism and homocysteine level in coronary atherosclerotic disease〔J〕.Arq Bras Endocrinol Metabol，2006;50(6):1059-65.