球形脂联素对糖基化终产物诱导血管内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白－1α的影响

孟 馨 吕景武 刘婷婷 王涤非 张 锦

(中国医科大学附属第一临床医院内分泌科，辽宁 沈阳 110001)

慢性炎症反应在动脉粥样硬化(AS)发生和发展中起着重要作用。巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)属于CC型趋化因子，可促进单核细胞黏附于血管内皮。糖尿病患者血浆葡萄糖水平持续增高产生蛋白和脂质非酶糖基化所形成的晚期糖基化终末产物(AGEs)是糖尿病病人主要特点之一〔1〕，本研究拟建立人脐静脉内皮细胞体外培养模型，制备AGEs，观察球形脂联素(gAdAPN)对AGEs诱导血管内皮细胞表达MIP-1α的干预作用，明确脂联素是否具有抗糖尿病As的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 gAdAPN、人血清白蛋白HSA、D-葡萄糖(美国Sigma公司);MIP-1α检测试剂盒 (Santa Cruz公司);RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)。

1.1.2 人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 PBS冲洗新生儿脐带静脉腔，0.25%的胰蛋白酶后收集内皮细胞悬液，离心后用150 mg/L内皮细胞生长添加物，75μmol/L肝素、20%胎牛血清的RPMI1640培养液吹打接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养，融合后予0.125%的胰蛋白酶、0.02%EDTA消化传代，第2～3代用于实验。细胞经Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色鉴定。

1.2 方法

1.2.1 体外晚期糖基化终产物的制备 0.5 g HSA，3.0 g D-葡萄糖，1 000μg青霉素，500μg庆大霉素溶于0.5 mol/L PBS(pH7.4)10 ml中，0.22μm微孔膜滤过除菌，恒温37℃避光孵育90 d，孵育结束以无菌的pH7.4的PBS透析，除去未结合的葡萄糖。以同样条件，不含D-葡萄糖孵育液培养的HSA作为对照。制备的AGEs修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA)经荧光分光光度计鉴定。

1.2.2 实验分组 先介绍如何分组每组实验重复3次。待细胞生长至亚融合状态时，改用无血清培养液继续培养12 h，PBS洗涤细胞3次，进行下列分组处理:①用含不同浓度梯度(100、200、400 mg/L)AGE-HSA的培养液对内皮细胞体外培养60 min及gAdAPN 100 nmol/L作用30 min后再加入400 mg/L糖基化终产物作用内皮细胞60 min;②以相同浓度及作用时间的未修饰HSA作为对照组。

1.2.3 内皮细胞MIP-1α蛋白的检测 内皮细胞接种于100 ml培养瓶中，于不同时间点收集细胞，提取蛋白。每个样品用15% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上，洗膜、封闭、杂交后加入ECL化学发光系统显影，感光后洗片。用美国Chemin Imager 5500型自动电泳凝胶成像分析仪进行MIP1-α蛋白相对定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS11.0进行统计学分析，数据以x±s表示，组间比较应用方差分析或检验。

2 结果

2.1 倒置显微镜下血管内皮细胞的形态 人脐静脉内皮细胞在倒置显微镜下呈铺路石状排列(图1)。

2.2 内皮细胞内MIP-1α蛋白的表达 Western印迹结果显示，AGEs组内皮细胞MIP-1α蛋白的表达明显高于对照组(P＜0.05)，且呈剂量依赖方式;经灰度值分析，各组内皮细胞内MIP-1α蛋白的表达量分别为对照组的1.12倍、1.47倍及1.98倍(P＜0.05)。gAdAPN干预组内皮细胞MIP-1α蛋白的表达降低至对照组的1.64倍(P＜0.05)。gAdAPN能降低AGEs诱导的内皮细胞MIP-1α蛋白的表达。见图2。

图1 血管内皮细胞在倒置显微镜下的形态(×400)

图2 各组内皮细胞MIP-1α蛋白的表达

3 讨论

趋化因子在白细胞迁移和浸润到血管壁这一动脉粥样硬化斑块形成的关键早期步骤中起着重要作用〔2〕。MIP-1α，一种属于趋化因子CC亚家族的单核细胞/巨噬细胞趋化因子，被证明有助于慢性炎症的形成。糖尿病患者包括冠状动脉、脑动脉和外周血管疾病等大血管并发症发生率明显增加，研究表明，AGEs通过多种途径参与其中〔3～5〕。本课题组前期研究结果显示，AGEs以时间及剂量依赖方式促进血管内皮细胞表达MIP-1α〔6〕，从而参与糖尿病动脉粥样硬化的形成。

脂联素是一种由脂肪组织分泌的具有抗炎和抗动脉粥样硬化作用的蛋白质。研究表明脂联素包含四个结构域:氨基末端的信号肽区、一小段非螺旋区、胶原结构域和羧基端的球形结构域，其中球形结构域(gAd)比全长脂联素具有更强的生物学作用，是脂联素主要的功能结构域。国内外研究表明，低脂联素水平预示着冠心病的发生，提示脂联素与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关〔7～9〕。脂联素能够特异性的与血小板源性生长因子结合，从而显著抑制平滑肌细胞的增殖与迁移。脂联素能抑制内皮细胞中血管细胞黏附因子、细胞间黏附因子及E-选择素的表达，从而减少由肿瘤坏死因子-α诱导的单核细胞对人主动脉内皮细胞的黏附。gAd通过激活AMPK抑制血管内皮细胞凋亡。糖尿病人大血管并发症的病理改变为动脉粥样硬化，但与非糖尿病病人相比发生早、进展快、预后差。本研究表明，gAdAPN能抑制糖基化终产物诱导人脐静脉内皮细胞表达MIP-1α，可能延缓糖尿病AS的发生和发展，为糖尿病大血管并发症的防治提供新的理论依据。

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