星点设计－响应面法优化北五味子多糖提取工艺

金 兰，张海晶，陈大忠

(黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨150040)

五味子为木兰科(Mrgnoliaceae)植物Schisandra chinensis(Turcz.)Bail.的干燥成熟果实，习称“北五味子”[1]，是著名的滋补性中药，始载于《神农本草经》，列为上品.我国五味子资源丰富，分布广泛，主产于吉林、辽宁、黑龙江、河北、内蒙古等地[2].五味子果实有益气生津，敛肺滋肾，止泻，涩精，安神的作用，可治久咳虚喘，津少口干，遗精久泻，健忘失眠等症[3].北五味子中化学成分为挥发性成分、木脂素类、有机酸类、多糖类、苷类、其他成分等[4].五味子多糖味酸、甘、温，具有收敛固涩，补肾宁心，益气生津之功效[5].在工艺优化过程中，常需同时考察多个因素对结果的影响，并对结果进行优化.国内常用均匀设计和正交设计，但该两种方法实验精度不够，建立的数学模型预测性较差.国外近年来常用星点设计－响应面优化法，是由于该法试验次数少，信息量大，直观，采用非线性预测模型，在中心点进行重复试验以提高精度，使预测值更接近真实值[6－8].本实验采用星点设计－响应面法对五味子多糖的提取工艺进行优化研究，为五味子多糖类化学成分研究提供科学参考.

1 材料与仪器

1.1 材料

实验药材采自于黑龙江省清河育林林场，经黑龙江中医药大学药学院中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为北五味子S.chinensis的干燥果实.

1.2 仪器与试剂

756PC型可见光紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)，电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，DK－98－1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，R－201旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司).葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯，水为双蒸水.

2 方法与结果

2.1 星点实验设计

根据文献报道和预试验，选择对工艺影响较大的因素，分别为提取温度、提取时间、溶剂倍数和提取次数.因提取次数属于非连续变量，回归处理较棘手，且预测值精度不能控制，固定提取3次.根据响应面分析法中中心组合设计(Central Composite)的原理，每个因素设5水平，分别用代码－α，－1，0，1，+α来表示，代码所代表的实际物理量见表1.

2.2 北五味子多糖得率的测定

2.2.1 供试品溶液的制备

精密称取已干燥至恒重的北五味子果实10.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入一定体积双蒸水，放入水浴中按恒定温度回流提取一定时间，过滤，提取3次，合并提取液.所得提取液浓缩至每1 mL含2 g生药，冷却后，搅拌下缓慢加入4倍体积的乙醇，混合均匀，放置在4℃冰箱醇沉24 h，以5 000 r/min离心20 min.所得沉淀，蒸干乙醇，得浸膏即为五味子多糖，并将该浸膏用双蒸水定容于250 mL量瓶中.

表1 星点设计因素水平表

2.2.2 标准曲线的制备

精密称取100.18 mg已干燥至恒重的标准葡萄糖，置于100 mL量瓶中，用双蒸水稀释至刻度，摇匀，得葡萄糖标准溶液.精密量取葡萄糖标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL转移至100 mL量瓶中，并用双蒸水定容至刻度，摇匀.取各浓度的标准液1.0 mL分别置于试管中，加入5%苯酚溶液2.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸6.8 mL，摇匀，室温放置15 min，30 ℃水浴中放置15 min，在波长为486 nm处测定吸光度值.以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，得回归方程Y=6.7 × 10－3X+2.39 × 10－2，相关系数 r=0.9984，线性范围是 10.018 ～100.18 μg.

2.2.3 精密度考察试验

精密吸取上述标准葡萄糖溶液1.0 mL，重复测定5次，标准葡萄糖溶液吸光度的RSD值为0.31%，表明此测定方法精密度良好.

2.2.4 稳定性考察试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、5、10、20、30、40 min内进行测定，其吸光度 RSD值为1.34%，表明供试品溶液在40 min内显色稳定.

2.2.5 重复性考察试验

精密吸取按照“2.2.1”项下供试品溶液的制备方法来制备的同一批五味子提取液6份，以双蒸水为空白溶剂，按照“2.2.2”项下方法进行平行处理，在486 nm处测定吸光度值，并计算出平均多糖得率为4.71%，RSD值为1.65%，表明该法具有良好的重复性.

2.2.6 加样回收率试验

取已知含量北五味子药材6份，每份精密称取10.0 g.置于圆底烧瓶中，精密加入适量标准品，按照“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备，精密吸取1.0 mL 供试品溶液，并按“2.2.2”项下方法显色处理，在486 nm波长处测定吸光度，计算出加样回收率平均值为99.12%，RSD值为0.98%，表明测定方法准确度较好.

2.2.7 北五味子多糖得率的测定

精密吸取供试品溶液1.0 mL于25 mL量瓶中，双蒸水定容，摇匀.精密量取1.0 mL于试管中，加入2.0 mL 5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入浓硫酸6.8 mL，摇匀，室温放置 15 min，30 ℃ 水浴中放置15 min，在486 nm处测定吸光度值.同时取相同体积双蒸水作为空白溶液，进行平行试验.

2.3 统计分析

精密称取已干燥至恒重的北五味子10.0 g，按表2试验号及上述方法进行提取和测定，测定北五味子中的多糖得率，试验安排与结果见表2.

表2 北五味子多糖提取工艺星点试验设计及结果

将所得数据用统计分析软件Design－Expert 7进行响应面分析，以多糖得率(Y)为因变量对各因素(X1、X2、X3)进行多元线性回归和二项式方程拟合.经软件对表2试验数据进行分析，拟合模型如下:多元线性回归方程:

二项式拟合模型方程:

根据上述结果分析，多元线性回归R2=0.639 2，P=0.02，模型不能通过检验，模型拟合度不高，预测性较差，因此不采用多元线性回归方程拟合.二项式拟合模型 R2=0.977 9，P ＜0.000 1，对方程中的各项系数进行方差分析(见表3)，删除不显著因素，方程简化为:

由表3结果可以看出提取温度和溶剂倍数对多糖得率有极显著的影响，提取时间无显著影响.二项式拟合模型方程失拟性(P＞0.05)，符合模型要求;二项式模型(P＜0.000 1)，有极显著水平，说明该方程拟合度良好，有较好的预测作用，可利用该模型分析最佳提取工艺条件.

表3 二项式拟合模型方差分析结果

续表3 二项式拟合模型方差分析结果

2.4 工艺参数优化与预测

因响应面只能表达2个因素的函数，所以固定3个因素中的1个为中值，即因变量与2个自变量拟合为三维曲面图，绘制因变量效应曲面图(见图1～3)，并结合简化后的二项式模型方程进行预测分析，多糖得率最大值为6.36%，最优工艺为:水为溶剂，提取温度为92℃，提取时间为171.6 min，溶剂倍数为21.55倍，提取3次.

图1 温度和提取时间对多糖得率的影响

图2 提取时间和溶剂倍数对多糖得率的影响

图3 温度和溶剂倍数对多糖得率的影响

2.5 验证试验

根据最优工艺条件进行验证，按“2.2.1”项下供试品溶液制备方法制备和按“2.2.2”项下方法对样品显色处理，平行做3组，实际测定得到多糖得率为 5.49%(RSD=1.46%，n=3，预测值为 6.36%).该结果表明，所建立的模型可靠，具有良好地预测性及所选工艺条件重现性良好.

3 讨论

近年来研究发现活性多糖具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫力、延缓衰老、降血脂、降血糖、解毒、抗辐射等功效，其作用日益受到人们的重视.五味子多糖是从五味子干燥成熟果实中可直接用水提取的混合物，具有保肝、抗疲劳、增强免疫、抗氧化及抗衰老、镇静催眠、抗肿瘤等药理作用.本实验为了充分发挥五味子多糖的功效，以多糖得率为考察指标，对北五味子多糖提取工艺进行优化，为北五味子多糖提取工艺相关行业的发展奠定了基础.星点设计－响应面优化法是多因素5水平的实验设计，通过预试验的基础上，确定合理的因素水平范围;并采用非线性拟合模型，并在中心点进行重复性试验提高其精确度，从而使预测值更接近实际值.本实验进行预试验的前提下，运用3因素5水平星点设计－响应面优化法对北五味子多糖提取工艺进行了优化.并最终确定最优工艺条件为以水为溶剂，在92℃下，用21.55倍量溶剂回流提取3次，每次171.6 min中，提取实际值与预测值偏差为－0.87%.此方法可用于北五味子多糖提取工艺行业中，是一种适用性广，简单合理，稳定性好，可预测性强的提取方法.

[1]中国药典一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010.61.

[2]石俊英.中药鉴定学[M].北京:中国医药科技出版社，2006.303.

[3]陈文静，季宇彬.北五味子多糖药理作用的研究进展[J].食品与药品，2007，9(12):66－67.

[4]闫丽丽，白军昌.五味子化学成分研究进展[J].中国新技术新产品，2011，7:17.

[5]可成有，马春雁，边 蔷，等.五味子多糖的研究概况分析[J].时珍国医国药，2009，20(7):1729－1731.

[6]吴 伟，崔光华.星点设计效应面优化法及其在药学中的应用[J].国外医学:药学分册，2000，27(5):292 －297.

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[8]郝 颖，东 方，金莉娜，等.响应面法优化黄芪多糖提取工艺[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版，2013，29(1)22－26.