酶解条件对淀粉颗粒聚集态结构的影响*

罗发兴 伍秀英 黄强 李超

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

作为自然界中最广泛的储能和供能物质之一，淀粉因来源广泛、价格低廉及可再生，被广泛应用于各大工业及食品领域．淀粉是由葡萄糖单元经糖苷键连接而成的大分子化合物，其颗粒由无定形区和半结晶区组成，其中无定形区由不规则排列的直链淀粉和支链淀粉组成，而半结晶区由结晶层和无定形层交替形成．结晶层由支链淀粉侧链形成的双螺旋结构紧密排列而形成，也有部分直链穿插其中，使结构更紧密;支链淀粉的分枝点及直链淀粉则构成无定形层［1］．淀粉不仅能为人和动物提供能量，还能在低温下酶解为葡萄糖和工业酒精等能源物质，这一现象受到越来越广泛的关注［2-3］．目前，有关淀粉颗粒酶解后结构变化的研究已经较多，文献［4-5］研究了不同种类的酶对同种淀粉结构的影响;文献［3，6-8］研究了淀粉的种类及水解度对结构的影响．但是截至目前，关于不同加酶量和酶解时间下获得的水解率相近的淀粉颗粒的聚集态结构差异的研究却鲜有报道．文中以普通玉米淀粉为原料，通过改变加酶量和酶解时间来研究其对淀粉颗粒结构的影响，同时采用扫描电子显微镜(SEM)、差示扫描量热(DSC)、小角X射线散射(SAXS)分析等方法对淀粉结构进行表征，以期为酶法淀粉改性提供理论指导．

1 材料和方法

1．1 材料

普通玉米淀粉，吉林中粮生化能源销售有限公司产品;苏宏葡萄糖糖化酶(酶活力为100000 U/mL)、ADN04390型中温α-淀粉酶(酶活力828IU/mL)，诺维信(中国)生物有限公司产品;一水合柠檬酸、磷酸氢二钠、3，5-二硝基水杨酸等均为市售分析纯试剂．

1．2 实验方法

1．2．1 淀粉的酶解

称取一定质量的普通玉米淀粉溶于pH值为5．0(pH值及反应温度均根据两种酶的最佳参数折中后获得)的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，配成23%(淀粉干基质量分数)的淀粉乳，加入一定量的复合酶(α-淀粉酶与葡萄糖糖化酶按体积比1∶3混合［8］)后于50℃恒温水浴锅中酶解，反应完成后，用5%(质量分数)的盐酸调节 pH值至3．0反应10min灭酶，用3%(质量分数)的NaOH中和溶液使pH值至6．0，真空抽滤，取滤液进行水解度测定，淀粉用去离子水洗涤3遍，抽滤，滤饼置于45℃的干燥箱中干燥48 h，粉碎，过80目筛，得到淀粉样品．每个样品重复两次．通过控制加酶量或酶解时间得到水解率接近的微孔淀粉．

1．2．2 水解率的测定

水解率的测定参考文献［9］的方法，得到标准曲线 y=6．7851x+0．0038，r2=0．9992．

1．2．3 SEM 分析

采用德国ZEISS公司生产的EVO18型扫描电子显微镜进行SEM分析．用导电双面胶将淀粉均匀分散在样品台上，真空条件下将样品喷金处理，置于扫描电子显微镜下观察，放大2000倍观察表面形态并进行拍摄．

1．2．4 DSC 分析

采用美国 Perkin-Elmer公司生产的DSC-8000型差示扫描量热仪对淀粉样品进行DSC分析．准确称取3mg淀粉于实验盘中，加入去离子水配成水分含量为75%(质量分数)的淀粉乳，封盘后放置12 h以平衡水分．以空盘为对照，然后以10℃/min的升温速率开始扫描，扫描温度范围为30～100℃．用Pyris软件计算起始温度(to)、峰值温度(tp)、终止温度(tc)及相变焓(ΔH)等特征参数．

1．2．5 SAXS 分析

采用奥地利Anton Paar公司生产的SAXSess型小角X射线散射仪进行SAXS分析，将淀粉样品与一定量去离子水混合，配成60%(质量分数)的淀粉乳，平衡8h后，置于毛细管样品皿中进行测试．测试条件:波长 =0．1542nm，管压40kV，管流50mA，样品与影像板间距21．2mm，曝光时间10min．

2 结果与讨论

2．1 酶解条件对淀粉水解率的影响

酶解时间与淀粉水解率的关系如图1所示．由图1可见，随着酶解时间的延长，淀粉的水解率增大，按水解速度的快慢可将酶解过程分为两个阶段:前8h水解率增长较快;8h后水解速度减慢，这与文献［10］的报道一致．这是因为在水解初期酶主要对无定形区进行水解，而后期主要作用于结晶结构，由于结晶结构较致密，因而水解速度减慢．

图1 酶解时间与淀粉水解率的关系Fig．1 Relationship between hydrolysis time and hydrolysis degree of starch

加酶量与水解率的关系如图2所示．由图2可见，加酶量小于3．33×10-6L/g(以每克干基淀粉所加酶的量计)时，水解率的增长速度较快，当加酶量超过3．33×10-6L/g后，水解速度减慢，且基本保持稳定．这可能是因为当加酶量低于3．33×10-6L/g时，酶主要作用于淀粉的无定形区，而当加酶量超过3．33×10-6L/g时，淀粉酶更多地向结晶区渗透进行水解，所以水解速度减慢．

图2 加酶量与淀粉水解率的关系Fig．2 Relationship between the amount of enzyme and hydrolysis degree of starch

2．2 淀粉表面形态变化

微孔淀粉在不同水解条件下的水解率(DH)如表1所示，水解后淀粉的SEM分析结果如图3所示．

表1 淀粉在不同水解条件下的水解率Table 1 Hydrolysis degree of starch samples under different hydrolysis conditions

图3 不同水解条件下淀粉样品的SEM照片Fig．3 SEM micrographs of starch samples under different hydrolysis conditions

由图3可见，随着水解率增加，淀粉表面微孔的孔径增大，淀粉颗粒破碎程度加深，从破碎的颗粒中可看到明显层状结构，在较高水解率下，破碎的颗粒内部出现大的空腔，与“由外至内”和“由内至外”的水解模式一致［11］．

比较加酶量和酶解时间不同、但水解率相近的样品(B1与 B2、C1与 C2、D1与 D2)发现，加酶量多的样品破碎程度更大，这可能是因为酶的增加导致淀粉表面开孔数增多［12］，淀粉颗粒结构减弱而破碎;比较水解率较高的D1、D2可发现，D2破碎程度更为明显，但酶解时间长的D1中，淀粉颗粒中心部分更多地被水解，形成了大的空腔．

2．3 淀粉热学性质变化

不同淀粉样品的热学性质参数如表2所示．由表2可见，随着水解率的提高，to总体升高，这是因为酶进入淀粉颗粒后，优先水解无定形区，从而导致残余淀粉颗粒的to上升［6］．ΔH与淀粉乳在加热过程中失去的双螺旋结构及熔化的单螺旋结构有关［13］，从表中所示结果可见，ΔH随着水解率升高而减小，这与文献［4，6］的报道一致，这是因为淀粉酶在水解无定形区的同时也作用于半结晶区和结晶区，导致酶解后淀粉颗粒中的结晶总量减少，因此ΔH降低．

水解率均在39%左右的淀粉样品D1和D2中，D1的ΔH更小，且与D2有显著差异．这可能是因为水解时间为15．0 h的样品颗粒内部被水解得更多(从SEM照片中可看出)，导致颗粒中心拥有更长B链的支链淀粉构成的双螺旋结构更多地被水解［14］，从而 ΔH 减小得更多．

表2 不同淀粉样品的热学性质1)Table 2 Thermal properties of different starch samples

2．4 淀粉颗粒半结晶结构的变化

SAXS可用来测量聚合物中结晶颗粒的大小、晶粒形状等．通过布拉格定律(d=2/q)可知:SAXS曲线的一个重要特征在于散射结构与对应的散射角间的负相关关系，其中d代表散射结构的尺寸或距离，q为相应的散射向量．淀粉的SAXS曲线在0．6nm-1左右出现的散射峰被认为与淀粉的半结晶区有关［15］，有研究者认为该峰的散射强度取决于半结晶区中有序结构的量或者无定形背景区和半结晶区(由重复的结晶层和无定形层构成)间的电子密度差［16］，Blazek 等［15］还认为无定形生长环的水解会导致SAXS曲线在低q区的散射强度增大．

不同淀粉样品的SAXS结果如图4所示．

图4 不同淀粉样品的SAXS曲线Fig．4 SAXS curves of different starch samples

从图4可以看出，在低q区原淀粉的散射强度最小，经水解后，淀粉在低q区的散射强度增大;比较水解率相近的淀粉(图4(a)、(b))，可发现酶解时间长的样品在低q区散射强度更大．而在0．6nm-1处的散射强度最大(4．44)，酶解淀粉的峰值强度减小，且4个酶解样品中，酶浓度最小的样品峰值散射强度最大(3．90)，其余3者没有明显差别．

酶解后淀粉样品在低q区的散射强度增大，而峰值强度减小的实验现象与之前文献报道［14，17-18］的一致．Blazek等［15］认为这是酶对淀粉无定形生长环的优先水解造成的．结合图4，可认为在酶解过程中，淀粉的无定形生长环被优先水解，且加酶量和酶解时间对淀粉结构的影响是不一样的，提高加酶量主要影响半结晶区的水解，而延长酶解时间主要影响无定形区的水解．

另外，由散射强度峰值所对应的散射向量q，通过布拉格定律可计算淀粉中半结晶层的厚度d．从图4可知，曲线的散射峰位置几乎无变化，所以酶解对半结晶层的厚度没影响．

3 结论

通过控制酶解时间和加酶量制得相近水解率的微孔淀粉，研究了两者对淀粉颗粒聚集态结构的影响，得出以下结论:

(1)加酶量多、酶解时间短的微孔淀粉破碎程度高于加酶量少、酶解时间长的样品;而后者淀粉颗粒的中心部分水解程度高于前者．

(2)随着水解率的增大，淀粉的焓值(ΔH)减小，在较高酶解程度下，酶解时间长的微孔淀粉焓值下降更明显，这可能与淀粉颗粒中心部分双螺旋结构的水解程度有关．

(3)酶解过程中，淀粉无定形区和半结晶区结构均发生改变;提高加酶量和延长酶解时间对淀粉结构产生不同的影响，提高加酶量主要影响半结晶区的水解，而延长酶解时间主要影响无定形区的水解．

［1］Blazek J，Gilbert E P．Application of small-angle X-ray and neutron scattering techniques to the characterisation of starch structure:a review ［J］．Carbohydrate Polymers，2011，85(2):281-293．

［2］Robertson G H，Wong D W S，Lee C C，et al．Native or raw starch digestion:a key step in energy efficient biorefinin of grain［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(2):353-365．

［3］Shaffifa Y N，Karim A A，Fazilah A，et al．Enzymatic hydrolysis of granular native and mildly heat-treated tapioca and sweet potato starches at sub-gelatinization temperature［J］．Food Hydrocolloids，2009，23(2):434-440．

［4］Li X，Gao W Y，Wang Y W，et al．Granule structural，crystalline，and thermal changes in native Chinese yam starch after hydrolysis with two different enzymes:α-amylase and gluco-amylase ［J］．Starch-Stärke，2011，63(2):75-82．

［5］Fean D S，Rachel M V D K，Slavko K，et al．Enzymatic degradation of granular potato starch by Microbacterium aurum strain B8．A ［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93(2):645-654．

［6］Xia Y Z，Guo W Y，Jiang Q Q，et al．Physicochemical，crystalline，and thermal properties of native and enzyme hydrolyze Pueraria lobata(Willd)Ohwi and Pueraria thomsonii Benth Starches ［J］．Starch-Stärke，2012，64(11):864-873．

［7］Tester R F，Qi X，Karkalas J．Hydrolysis of native starches with amylases［J］．Animal Feed Science and Technology，2006，130(1/2):39-54．

［8］江慧娟，黄赣辉．复合酶法制备葛根多孔淀粉［J］．食品科学，2011，32(18):91-94．Jiang Hui-juan，Huang Gan-hui．Preparation of porous arrowroot starch by double enzymatic hydrolysis［J］．Food Science，2011，32(18):91-94．

［9］赵凯，徐鹏举，谷广烨．3，5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量的研究［J］．食品科学，2008，29(8):534-536．Zhao Kai，Xu Peng-ju，Gu Guang-ye．Study on determination of reducing sugar content using 3，5-dinitrosali-cylic acid method ［J］．Food Science，2008，29(8):534-536．

［10］Chen G，Zhang B．Hydrolysis of granular corn starch with controlled pore size ［J］．Journal of Cereal Science，2012，56(2):316-320．

［11］Karim A A，Sufha E H，Zaidul I S M．Dual modification of starch via partial enzymatic hydrolysis in the granular state and subsequent hydroxypropylation ［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(22):10901-10907．

［12］阮杨峰，周裔彬，宋岑，等．酶量和酶解时间对玉米多孔淀粉制备效果的影响［J］．农产品加工学刊，2012(6):19-22．Ruan Yang-feng，Zhou Yi-bin，Song Cen，et al．Influence of enzyme concentration and enzymolysis time on preparation effect of porous corn starch［J］．Academic Periodical of Farm Products Processing，2012(6):19-22．

［13］Cooke D，Gidley M J．Loss of crystalline and molecular order during starch gelatinisation:origin of the enthalpic transition［J］．Carbohydrate Research，1992，227:103-112．

［14］Pan D D，Jane J L．Internal structure of normal maize starch granules revealed by chemical surface gelatinization ［J］．Biomacromolecules，2000，1(1):126-132．

［15］Blazek J，Elliot P G．Effect of enzymatic hydrolysis on native starch granule structure［J］．Biomacromolecules，2010，11(12):3275-3289．

［16］Yuryev V P，Krivandin A V，Kiseleva V I，et al．Structural parameters of amylopectin clusters and semi-crystal-line growth rings in wheat starches with different amylose content［J］．Carbohydrate Research，2004，339(16):2683-2691．

［17］Roberta C S T，Harry W，Mateus B C，et al．Effect of the alkaline treatment on the ultrastructure of C-type starch granules［J］．Biomacromolecules，2008，9(7):1894-1901．

［18］Shrestha A K，Blazek J，Flanagan B M，et al．Molecular，mesoscopic and microscopic structure evolution during amylase digestion of maize starch granules［J］．Carbohydrate Polymers，2012，90(1):23-33．