Maillard反应体系中亚硫酸根对2-氨基-2-脱氧葡萄糖降解的影响*

于淑娟 马菲 徐献兵

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

美拉德反应(Maillard Reaction)，又称非酶褐变或羰氨反应，是还原糖(碳水化合物)与氨基酸/蛋白质在常温或加热时发生的一系列复杂的反应，最终生成棕色甚至黑色的高分子类黑精(或称拟黑素)［1-6］．美拉德反应过程一般可归纳为初始阶段、中间阶段和高级阶段3个阶段．在初始阶段，酮糖可与氨基化合物生成酮糖基胺，而酮糖基胺可以经过海恩氏(Heyns)分子重排异构成2-氨基-2-脱氧葡萄糖;此外，含有醛基的还原糖(如葡萄糖)的羰基与氨基酸或蛋白质中的自由氨基脱水缩合生成N-葡萄糖基胺，N-葡萄糖基胺经Amadori分子重排转变成1-氨基-1-脱氧-2-酮糖．在中间阶段，Heyns重排产物2-氨基-2-脱氧葡萄糖发生重排、脱氨基等反应，生成二羰基化合物等中间体，同时Heyns重排产物在高温下会直接裂解生成丙酮醇、丙酮醛等活性物质［7］，其中丙酮醛是一种 1，2-二羰基化合物，是该阶段中1，2-烯醇化、2，3-烯醇化和逆羟醛反应的重要活性产物［8-9］;Amadori重排产物 1-氨基-1-脱氧-2-酮糖则经重排、脱氨、Strecker降解、裂解等反应生成醛类、丙酮醛等二羰基化合物类活性中间体［10-13］．在高级阶段，众多活性中间体及杂环类化合物等经过极其复杂的反应生成棕色甚至是黑色的类黑精［10-13］．

随着人们对美拉德反应历程的深入研究，亚硫酸根对美拉德反应褐变的抑制作用已经得到证实［14-16］，但以2-氨基-2-脱氧葡萄糖作为初始美拉德反应物研究亚硫酸根对反应中间产物及褐变程度的影响却鲜见报道．由于葡萄糖多以半缩醛形式存在，亚硫酸根基本不与葡萄糖直接发生反应［14］，文中以美拉德反应中间产物2-氨基-2-脱氧葡萄糖为起始反应物，同时监测美拉德反应中重要的中间产物丙酮醛的变化，研究亚硫酸根对2-氨基-2-脱氧葡萄糖及其降解产物的影响．

1 实验

1．1 材料与设备

甲醇，色谱纯，德国 Merck公司产品;2-氨基-2-脱氧葡萄糖(氨基葡萄糖)、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二胺(OPD)，分析纯，美国Sigma公司产品;乙醇、碳酸钠、碳酸氢钠，色谱纯，美国Sigma公司产品;亚硫酸钠，分析纯，广州化学试剂有限公司产品;实验用水为蒸馏水．

Waters 600高效液相色谱仪、Waters Atlantis T3色谱柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)、Waters 2998 型二极管阵列检测器，美国Waters公司生产;ICS 5000型高效离子色谱仪，美国Dionex公司生产;TU-1901型紫外-可见分光光度计，北京普析通用有限责任公司生产;PL403型分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司生产;电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司生产．

1．2 实验方法

1．2．1 样品制备

分别加入 0、4、40、400 mmol亚硫酸钠于 1 L 氨基葡萄糖溶液(40 mmol/L，以pH=7．4的磷酸盐缓冲溶液为溶剂)中，并充分混匀，110℃密闭反应0．5、1．0、2．0、3．0 和4．0h，冰水浴冷却至室温，4℃保存备用．

参考 Gobert［13］、Arena 等［17］的方法，利用邻苯二胺衍生化丙酮醛．准确称取0．01 g邻苯二胺溶于20mL pH=7．4的磷酸缓冲溶液，配制成0．5 g/L的邻苯二胺衍生试剂．分别取1mL上述反应后的样品溶液与1mL衍生试剂混合均匀后，于37℃静置12h后进行分析测定．

1．2．2 美拉德反应样品的吸光度测定

按照文献［18］的方法测定美拉德反应产物的吸光度．分别取20μL样液加入3mL去离子水稀释，测定420nm下的吸光度．

1．2．3 美拉德反应体系中丙酮醛含量的测定

参照Gobert等［13］的方法，通过邻苯二胺衍生法监测丙酮醛含量．衍生化后的样品过0．45 μm微孔滤膜，以备HPLC分析．选用Waters 600型高效液相色谱仪、Waters 2998型二极管阵列检测器和Waters Atlantis T3 色谱柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)组成HPLC分析系统，HPLC条件如下:流动相采用水-甲醇进行梯度洗脱，首先用5%(体积分数，下同)的甲醇洗脱5min，然后用5% ～30%甲醇梯度洗脱5min，再用30% ～40%甲醇梯度洗脱35min，最后用100%甲醇洗脱15min;流速设置为1mL/min;柱温为25℃;进样量为20μL．

美拉德反应体系中丙酮醛衍生物(2-甲基喹喔啉)的保留时间为27．6 min，检测范围为0．002～3．200mmol/L．丙酮醛标准曲线的回归方程为A=107c，r2=0．9999，其中:c为丙酮醛浓度，mmol/L;A为2-甲基喹喔啉峰面积．

1．2．4 美拉德反应体系中还原糖含量的测定

精确移取100μL样液，加入5mL去离子水稀释后过0．45 μm微孔滤膜，以备高效阴离子色谱-电化学(HPAEC-ED)分析．选用Dionex ICS 5000型离子色谱仪、CarboPac PA1阴离子交换柱(250 mm×4mm)和保护柱(50 mm×4 mm)组成HPAEC-ED分析系统．色谱条件如下:淋洗液A液为500 mmol/L的NaOH，B液为去离子水;先用浓度为5%(体积分数，下同)的 A液等度洗脱20 min，再用浓度为100%的A液洗脱10 min，流速为1 mL/min，进样量为20μL，柱温为30℃．

美拉德反应体系中氨基葡萄糖、葡萄糖、果糖的保留时间分别为 10．97、13．50、18．00 min．氨基葡萄糖、葡萄糖和果糖的线性回归方程分别如下:

其中，y1、y2、y3分别为氨基葡萄糖、葡萄糖和果糖的峰高，x1、x2、x3分别为氨基葡萄糖、葡萄糖、果糖的浓度．

2 结果与讨论

2．1 美拉德反应产物色值的变化

通过测定420nm处的紫外吸光度(A420)来监测亚硫酸钠-氨基葡萄糖反应体系的色值［18］．亚硫酸根对氨基葡萄糖-亚硫酸根体系A420的影响如图1所示．

由图1可见，反应开始后的前0．5h，反应体系的A420显著增加，此后进一步延长反应时间，A420变化不显著;同时发现，增大体系中的亚硫酸根浓度可降低反应体系的A420．上述结果表明，随着反应时间的延长，美拉德反应向高级阶段进行并形成类黑精，加入亚硫酸根可抑制类黑精的形成．有文献报道［19-21］，在美拉德反应高级阶段，类黑精主要是通过体系中二羰基化合物的羟醛缩合聚合生成的一种高分子化合物．由于亚硫酸根具有很强的亲核反应能力，很容易与体系中的二羰基化合物发生亲核反应，并生成磺酸盐缩合产物，这种产物可抑制羟醛缩合反应的进行，从而抑制美拉德反应高级阶段类黑精的生成．

图1 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中A420的变化Fig．1 Change of A420in glucosamine-sulfate model system during heating

2．2 美拉德反应体系中丙酮醛含量的变化

利用HPLC检测不同亚硫酸根含量下氨基葡萄糖-亚硫酸根反应体系反应0．5 h后丙酮醛的含量［9］，反应体系的高效液相色谱图如图2所示．

图2 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应0．5h后的高效液相色谱图Fig．2 High-performance liquid chromatograms of glucosaminesulfate model system after heating 0．5h

由图2可见，在美拉德反应的复杂产物中，丙酮醛(MGO)是反应体系中变化最明显的中间产物，通过对其进行监测来研究亚硫酸根对美拉德反应中间产物的影响具有代表性．

反应体系中丙酮醛含量的变化如图3所示．由图3可见:当亚硫酸根浓度小于4 mmol/L时，反应体系中丙酮醛的含量相对较少;反应体系中亚硫酸根的浓度增大到40或400 mmol/L时，体系中的丙酮醛含量明显增加，但随反应时间的延长(大于1h)丙酮醛含量降低．上述结果表明，亚硫酸根的加入可促进美拉德反应体系中丙酮醛的生成，延长反应时间，丙酮醛发生降解形成类黑精等高级阶段产物．

图3 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中丙酮醛浓度的变化Fig．3 Change of MGO in glucosamine-sulfate model system during heating

2．3 美拉德反应体系中还原糖含量的变化

利用高效离子交换色谱仪监测亚硫酸根浓度对氨基葡萄糖-亚硫酸根反应体系的影响，结果如图4所示．

图4 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中的高效离子色谱图Fig．4 High-performance anion exchange chromatograms of glucosamine-sulfate model system during heating

反应体系中氨基葡萄糖含量的变化如图5所示．由图5可见，在亚硫酸钠含量不同的反应体系中，氨基葡萄糖基本都在反应1 h后完全降解，且降解速率无显著差异，说明亚硫酸根并没有抑制氨基葡萄糖的降解．

图5 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中2-氨基-2-脱氧葡萄糖浓度的变化Fig．5 Change of 2-amino-2-deoxyglucose in glucosaminesulfate model system during heating

亚硫酸根浓度对反应体系中葡萄糖含量的影响如图6所示．由图6可见:当反应体系中无亚硫酸根时，体系中仅产生少量葡萄糖且迅速降解;当反应体系中加入少量亚硫酸根(4 mmol/L)时，体系中葡萄糖的含量显著增加，但此后继续增加亚硫酸根含量，葡萄糖含量显著降低．这一结果说明，体系中少量硫酸根的存在有利于葡萄糖的生成，过量亚硫酸根可促进体系中葡萄糖的消耗．产生上述现象的主要原因是亲核试剂亚硫酸根进攻氨基葡萄糖中的含氮碳原子，促进氨基葡萄糖发生脱氨反应并进一步水解产生葡萄糖，当体系中加入过量的亚硫酸根时，多余的亚硫酸根会同时与葡萄糖的羰基发生亲核加成反应而消耗葡萄糖．

图6 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中葡萄糖浓度的变化Fig．6 Change of glucose in glucosamine-sulfate model system during heating

亚硫酸根浓度对反应体系中果糖含量的影响如图7所示．由图7可见:当反应体系中无亚硫酸根时，仅有少量的果糖产生且很快被消耗完;当反应体系中加入亚硫酸根时，亚硫酸根对体系中果糖含量的影响规律与葡萄糖的基本一致．综合图6、7可见，加入相同量的亚硫酸根时，果糖的含量明显多于葡萄糖的含量．据文献报道［11，22］，在碱性环境中，Heyns分子重排产物可通过逆重排反应生成果糖．本实验中亚硫酸根的加入可促进氨基葡萄糖的逆重排反应从而生成果糖．产生上述现象的另一种原因是:氨基葡萄糖脱氨生成的葡萄糖在弱碱性条件下发生异构化生成果糖．另外，当反应体系中加入过量的亚硫酸根时，亚硫酸根可与果糖的羰基发生亲核加成反应，从而消耗果糖．

图7 氨基葡萄糖-亚硫酸根体系加热反应过程中果糖浓度的变化Fig．7 Change of fructose in glucosamine-sulfate model system during heating

2．4 亚硫酸根对美拉德反应体系的影响机理分析

综合前文的分析，推断亚硫酸根对美拉德反应体系的影响机理如图8所示．2-氨基-2-脱氧葡萄糖在pH=7．4环境下高温加热，发生以下3个路径的反应历程:

(1)2-氨基-2-脱氧葡萄糖在碱性环境下发生逆重排反应，经1，2烯醇化反应得到1，2-烯醇胺，进而生成亚胺正离子，经可逆反应得到席夫碱，最后经过化合物1生成果糖，该过程被称作Heyns逆重排反应［11，22］，体系中的亚硫酸根促进了 2-氨基-2-脱氧葡萄糖经Heyns逆重排反应生成果糖，使反应体系中的果糖含量增加，另一方面果糖又与亚硫酸根离子亲核加成生成化合物2，从而消耗掉体系中的果糖，因此，随着体系中亚硫酸根含量的增加，体系中果糖逐渐被消耗;

图8 亚硫酸根存在下2-氨基-2-脱氧葡萄糖的降解机理推断Fig．8 The proposed mechanism for the degradation of 2-amino-2-deoxyglucose in the presence of sulfite

(2)2-氨基-2-脱氧葡萄糖的氨基被亚硫酸根取代生成化合物1，进而又脱去磺基生成葡萄糖，葡萄糖在弱碱性条件下经1，2-烯醇化异构生成果糖，同时亚硫酸根与反应体系中的葡萄糖经亲核加成反应生成化合物5，使得葡萄糖被消耗;

(3)2-氨基-2-脱氧葡萄糖脱羟基生成化合物6，又重排生成化合物7，经脱氨基生成3-脱氧-1，2-二羰基化合物，在pH值大于7的高温条件下，裂解生成丙酮醛、丙酮醇等中间产物，中间产物进一步聚合生成高级产物类黑精［10-13］，但是体系中的亚硫酸根与丙酮醛易通过亲核加成反应生成化合物8和9，这一过程抑制了丙酮醛直接聚合生成类黑精，从而抑制了体系中色值的上升．

3 结论

2-氨基-2-脱氧葡萄糖是果糖与铵盐在美拉德初级反应阶段产生的一种典型的Heyns重排产物．文中以2-氨基-2-脱氧葡萄糖为初始美拉德反应物，分别加入不同量的亚硫酸钠，在110℃下反应不同时间．通过紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪及高效离子交换色谱仪分析了亚硫酸根对体系褐变程度、丙酮醛含量、2-氨基-2-脱氧葡萄糖含量、葡萄糖含量及果糖含量的影响．得出如下结论:

(1)亚硫酸根可显著抑制反应体系的褐变、促进裂解产物丙酮醛的产生;

(2)亚硫酸根对2-氨基-2-脱氧葡萄糖的降解没有抑制作用;

(3)体系中少量亚硫酸根的存在有利于葡萄糖的生成，过量亚硫酸根可促进体系中葡萄糖的消耗;

(4)亚硫酸根对体系中果糖含量的影响规律与对葡萄糖的基本一致．

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