根霉在发酵工业与环境科学中的研究进展

刘金梅 张凤英

（江西农业大学食品科学与工程学院，南昌 330045）

根霉菌属藻菌纲（Phycomcetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、根霉属（Rhizopus Ehrenberg），根霉种（Rhizopus spp.），是自然界中广泛存在的一类真菌，千百年来一直是我国数种传统发酵食品的重要发酵菌［1］。发酵工业中应用的根霉纯种主要是从自然发酵食品和传统酒曲中筛选获得。根霉属包括米根霉、华根霉和少孢根霉等种。目前中国工业微生物保藏中心保藏的根霉种主要有14种：雪白根霉（Rhizopus niveus）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）、爪哇根霉（Rhizopus javanicus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、 戴 尔 根 霉（Rhizopus delemar）、华根霉（Rhizopus chinensis）及小孢根霉（Rhizopus microsporus）等。其中，米根霉（Rhizopus oryzae）是经美国FDA认证的安全菌株，所需营养源简单，是根霉菌种中被研究最多得菌种之一。根霉的代谢产物如乳酸、富马酸、L-苹果酸及消化酶等有重要的经济价值［2-4］，广泛用于食品、医药及饲料等行业。由于根霉产糖化酶活力很高，利用根霉制曲酿酒酿醋早已在食品工业广泛应用，中国是最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精的国家。目前相关研究又证明腐乳、酱油、豆酱、豆腐糕、霉豆渣及丹贝等天然发酵食品中均含有丰富的根霉菌。近年来，国内外又有部分专家对根霉菌在环境科学领域的应用展开了研究，并取得了一定的成果。随着根霉菌特殊代谢产物研究的不断深入，相关产品的研发也越来越受到重视。

1 根霉在发酵工业中的应用

1.1 根霉在酸味剂的科研生产中的应用

1.1.1 根霉产L-乳酸 L-乳酸是一种非常重要的有机酸，是目前最具发展前途的有机酸之一，广泛应用于在食品、医药卫生、纺织、皮革等领域。特别是由L-乳酸聚合而成的聚L-乳酸，具有生物降解性和生物相容性，是良好的绿色包装材料，对减少“白色污染”具有重要的意义［5-7］。

在自然界中，有众多产有机酸的微生物，但根霉因其营养要求简单，菌丝体大而易于分离，产酸能力强且产物的光学纯度高、易于精制而被普遍应用于工业生产，成为国内外广范采用的发酵菌种。根霉产生的淀粉酶及糖化酶，能利用糖、淀粉或淀粉质原料生成乳酸。迄今为止，米根霉被认为是最适合生产乳酸的菌种之一。2008年，秦菊霞等［8］以米根霉3038为出发菌株，经诱变得到1株适合甘蔗糖蜜（干固形物约含40%蔗糖和15%还原糖）发酵生产乳酸的突变株，以三步处理后的糖蜜15%为碳源，发酵4 d的乳酸产量为60.0 g/L；Kelly［9］利用根霉（R. arrhizus）以废弃的土豆淀粉作为基质发酵生产乳酸，比较不同氮源硫酸铵、硝酸铵、尿素、酵母提取物、蛋白胨及碳氮比对乳酸生成量的影响，试验表明，较低的碳氮比有助于提高乳酸的产量，较高的碳氮比有助于生产富马酸，硝酸铵为产乳酸最佳氮源。大量的数据分析表明，高浓度的硝酸铵有助于提高乳酸的产量，乳酸的最高产量为36.4 g/L，转化率达到了91%。Chotisubha-anandha等［10］以固定床生物反应器固定化米根霉产乳酸，试验结果表明，当生物反应器的转速和通气比为700 r/min和0.5 vvm，葡萄糖浓度为70 g/L时，乳酸产率最高达2.09 g/L·h，最终浓度为37.83 g/L。

1.1.2 根霉产富马酸 富马酸是一种含双键的二元羧酸，作为重要的有机化工原料和精细化工产品，在材料（树脂、涂料及增塑剂等）、医药、化工、食品及饲料添加剂等领域应用广泛。同时，富马酸可作为合成多种高价衍生物的原料，如富马酸亚铁、富马酸二甲酯等。另外，富马酸还是一种重要的四碳平台化合物，通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺，可用来生产L-天冬氨酸、琥珀酸、苹果酸、1，4-丁二醇、四氢呋喃等四碳化合物，因此被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一。富马酸主要是以葡萄糖为原料，利用根霉等丝状真菌经耗氧发酵产生的。当前生产富马酸法主要有顺酐（又称马来酸酐）异构法、糠醛氧化法、马来酸酶催化异构法、石蜡发酵法等，工业上主要采用顺酐异构法，因为其他方法采用的原料均为石油基产品，而石油资源供应日趋紧张，故而产品的市场竞争力逐渐下降。

因根霉菌（Rhizopus sp.）产富马酸能力较强，且具有营养需求简单、生长迅速及环境适应能力强等优点，从而成为重点研究对象。据目前所报道的文献来看，米根霉和少根根霉是研究以碳水化合物或其他可再生物质为原料生产富马酸工艺中使用最多的菌种，其中米根霉是目前已报道文献中生产强度最高的菌种，而少根根霉是产量和转化率最高的菌种。早在1989年，Kautola和Linko［11］用固定化少根根霉TKK 204-1-1a生产富马酸，通过统计试验设计和经验建模进行分批发酵的优化设计，在木糖浓度为6%，碳氮比为160∶1时富马酸的浓度达到最高。在此优化条件下，发酵时间为1.75 d时，达到最高体积产率为每小时87 mg/L；发酵时间为10.25 d时，最高产物浓度达16.4 g/L。刘宁等［12］探讨了不同浓度的初始葡萄糖以及有机氮源酵母膏和无机氮源（NH）2SO4对少根根霉合成富马酸的影响。并以此为基础采用响应面分析方法优化了富马酸的产量以及其转化率。研究结果表明，当葡萄糖和（NH）2SO4的浓度分别为121.2 g/L、2.23 g/L时，富马酸的最大转化率为55.16%，当葡萄糖和（NH）2SO4的浓度分别为162.0 g/L、3.0 g/L时，富马酸的最大产量为75.15 g/L，相比优化前的结果，富马酸产量得到明显提高。

南京工业大学制药与生命科学学院张昆等利用Modeller7v7软件对米根霉富马酸酶（fumarase）进行了三级结构的同源建模，并验证了结果在空间和能量上的合理性，进一步对酶的结构域和催化活性位点进行了研究。结果表明，富马酸酶由3个结构域组成，中心区域为一个由5个几乎平行的α-螺旋组成的独特的束型结构，其催化活性位点是由3个亚基上的氨基酸相互靠近共同组成的［13］。为有针对性的进行富马酸酶的定点突变提高富马酸产量提供分子水平上的理论指导。

1.1.3 根霉产L-苹果酸 L-苹果酸主要作为酸味剂和保鲜剂用于食品工业，是继柠檬酸、乳酸之后的世界第三大酸味添加剂，亦是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。由于其口感接近天然果汁并具有天然香味，且较之于柠檬酸，L-苹果酸产生的热量及其刺激性更低，口味更好。因此广泛应用于酒类、饮料、果酱、口香糖等多种食品中，未来可能具有逐渐代替柠檬酸的趋势。此外，L-苹果酸还具有一定的生理功能，在医药及保健品等领域也有重要应用。

能直接利用糖质原料一步发酵生产L-苹果酸的微生物有黄曲霉和根霉，但黄曲霉因其次生代谢产物中可能存在对人体及动物有致癌作用的黄曲霉毒素而倍受争议。而根霉所产的L-苹果酸通常是其生产L-乳酸和富马酸过程中的一种中间代谢产物，一般需通过改变其传统代谢途径，才能达到累积的目的。研究发现，米根霉积累富马酸的代谢途径与黄曲霉积累L-苹果酸的途径类似。田三德等［14］采用华根霉和毕赤酵母菌株混合培养发酵生产L-苹果，分别从葡萄糖浓度、华根霉接种量、混合培养方式及聚乙二醇添加量4个方面探讨了其对发酵生产L-苹果的影响，通过正交试验确定其优化组合，在优化条件下，L-苹果酸产量达78.9 g/L，对投糖浓度的摩尔转化率为87.4%。何皓等［15］考察了富马酸酶活抑制剂放线菌酮对米根霉发酵产L-苹果酸和富马酸的影响。结果表明，发酵16 h加入浓度15 mg/L的放线菌酮使米根霉富马酸酶胞质同功酶比活力峰值降低48.7%，而苹果酸脱氢酶胞质同功酶活力却未有明显改变，生成的富马酸比对照样减少37.1%，而L-苹果酸积累量提高54.6%，达到21.7 g/L。表明通过对米根霉富马酸酶胞质同功酶的抑制作用能减弱米根霉积累富马酸代谢途径中由L-苹果酸向富马酸的转化，从而促进米根霉积累L-苹果酸。

1.2 根霉在生物酶发酵中的应用

1.2.1 根霉产糖化酶 根霉在发酵代谢过程中能产生多种淀粉酶，包括α-淀粉酶（α-amylase，EC3.2.1.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（β-amylase，EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（Glucoa-Mylase，EC3.2.1.3），也叫 γ-淀粉酶，简称糖化酶（缩写GA 或G）；异淀粉酶（isoamylase，EC3.2.1.68，糖原6-葡聚糖水解酶）等。其中糖化酶可以迅速的从淀粉的非还原性末端将淀粉水解，释放出葡萄糖，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。它也可以微弱的水解α-1，6糖苷键和α-1，3连接的碳链，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油和淀粉糖等工业生产中，是我国产量最大的酶制剂产品［16］。最早在全国酿酒行业推广应用，被公认为性能优良的酿酒用根霉糖化菌Q303是由贵州省轻工业研究所于1977年分离。该菌种主要糖化力强、适应性强、性能稳定，可用于不同原料酿造小曲酒、甜酒酿、黄酒的生产，是我国应用最广的根霉糖化菌。但Q303也有缺陷：Q303在培菌过程中会在米粉基质表面产生大量的黑孢子，从而使做出的酒饼丸表面易发黑，为消费者所不能接受，所以Q303不太适合用于做米粉曲（酒饼丸），更适合做麸皮散曲。针对Q303的缺点，于博和马蕤等［17，18］自2000年以来成功分离2株米根霉菌株（R. oryzae F6和R. oryzae F14），糖化酶活力高，在繁殖过程中产生的黑孢子较少、颜色也较浅，一般在生产基质上不会呈现肉眼可见黑孢子，而且酿造的酒的风味独特。现已在多个酒曲厂推广应用。王旭亮等［19］以不同香型大曲为筛选源分离得到96株霉菌，经过系列工艺过程，筛选出一株优势霉菌，其纯种曲糖化力、发酵结束后培养基中酒精浓度、出酒率分别为2 657.00 U/g、15.40 mL/100 g、42.73%，经鉴定后该优势菌确定为米根霉。甜酒曲中的糖化菌种主要是以米根霉为主。

1.2.2 根霉产脂肪酶 微生物因具有产脂肪酶种类多，成本低，产量高等优点而成为脂肪酶的重要来源［20］。脂肪酶可以用来催化酯类化合物的水解、酯化、醇解、酯交换及合成等，反应无需辅酶、能耗低、条件温和、底物原料品质要求低、副产物少，主要用于食品加工、生物柴油制备、手性药物拆分、生物传感器（酶传感器）等领域。根霉是脂肪酶的重要生产菌，且根霉脂肪酶多具有高度的1、3位置专一性，可优先水解饱和脂肪酸链（C8-C18），根霉该特性使其在含油脂食品的增香、芳香酯及其他酯类的合成以及某些手性化合物的拆分等方面受到广泛关注。

根霉在产脂肪酶方面的研究大多集中在诱变选育及发酵条件优化等方面。如孙春艳等［21］采用紫外线、硫酸二乙酯及两者的复合对实验室保藏的1株高产耐热脂肪酶的根霉SFE-L01菌株进行诱变处理，筛选获得1株突变株UD-23，产耐热脂肪酶活力比出发菌株提高了112.39%，达24 000.00 U/mL。冀颐之等［22］通过单因子和正交试验，对无载体固定化少根根霉N-103产脂肪酶的发酵培养基进行研究。在优化条件下，少根根霉脂肪酶酶活可达100 U/mL，为基础培养基配方对照组的1.33倍。魏涛等［23］对根霉zz-3脂肪酶的产酶条件进行了优化并对其脂肪酶酶学性质进行了研究。结果显示，250 mL三角瓶液体培养，装液量100 mL，该根霉产脂肪酶的最佳培养基为：黄豆粉3 g/100 mL，（NH4）2SO40.3g/100 mL，MgSO40.2 g/100 mL，K2HPO40.2 g/100 mL，花生油0.3 g/100 mL，pH自然。在温度28℃、转速150 r/min，摇床培养2 d，发酵酶活力达124.60 U/mL。该酶酶学性质的初步研究结果为：最适反应温度为37℃，最适为pH7.5，在温度低于40℃、pH7-9条件下酶活稳定。冀颐之等［24］采用低能N+离子注入技术，对少根根霉BUCT-11进行诱变选育，以达到提高脂肪酶产量的效果。试验结果表明：经诱变后，筛选得到高产脂肪酶突变菌株N103，经摇瓶发酵，测得脂肪酶水解酶活力为175 U/mL，是出发菌株产量的165%，且其遗传稳定性较好。

综上所述，现有研究均是从诱变育种和环境因子（pH值、接种量及培养基成分等）对根霉生产代谢各种有机酸和生物酶的影响，从而优化根霉发酵生产工艺。鲜有从基因水平探索根霉菌种与其次级代谢产物之间的内在关系。

1.3 根霉在大豆发酵食品中的应用

1.3.1 根霉在丹贝中的应用 丹贝又名天培，是一种以大豆为原料，经根霉发酵后制成的发酵食品，起源于印度尼西亚，在泰国、马来西亚等东南亚国家被广泛使用，是世界上唯一作为主食的大豆发酵食品。丹贝中的微生物是以根霉为主，另有革兰氏阴性杆菌及芽孢杆菌。早在1963年，Hesseltine等［25］在丹贝中收集和分离得到40株根霉，主要以少孢根霉为主，另有葡枝根霉、少根根霉、米根霉等共6种根霉，且这些根霉均可用纯培养方法制成丹贝。鲁菲等［26］对从源于印度尼西亚的丹贝中分离出的一株优势霉菌进行了鉴定，确定其为米根霉种。刘全德等［27］用少孢根霉、乳酸菌及甜酒曲共同发酵大豆基质制作丹贝，该丹贝氨基酸含量等营养成分趋于平衡，营养和风味明显改善。

1.3.2 根霉在腐乳中的应用 豆腐乳是一种具我国民族特色的酿造食品，具有独特鲜美的味道、价格便宜、营养丰富，备受人们喜爱。豆腐乳在发酵过程中能产生蛋白酶，催化变性后的蛋白质水解成多种游离氨基酸，以及水溶性多肽等功能性成分，具有广阔的开发前景。根霉菌是发酵产腐乳的主要菌种之一，谭平等［28］对津市地方风味腐乳中的菌种进行分离与扩大培养，在无杂菌污染的情况下分别采用了固体扩大培养及液体扩大培养两种方法，结果分离出3株毛霉，2株根霉。秦恩华等［29］对根霉发酵豆腐乳过程中游离氨基酸和可溶性蛋白酶进行了检测，结果表明，两者的动态变化不稳，前者总体呈下降趋势，后者总体呈上升趋势，分别在20 h和24 h达到最大值。张斌等［30］利用鲁氏毛霉和米根霉两株优势菌，在最优条件发酵得到的成品腐乳具有整齐的块形、乳黄色的色泽，具备优品腐乳的特性。

1.3.3 根霉在酱油中的应用 酱油制造主要是利用微生物酶的催化作用。制曲是酱油发酵非常重要的一环，微生物在原料上代谢生长，产生大量的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等酶类，以备后期发酵所用，其中蛋白酶尤为重要，它能影响原料蛋白利用率和终产品的风味。根霉并不是生产酱油的最优势菌群，但多菌种发酵制备酱油是酱油酿造行业的一项先进技术。靳文生［31］用米曲霉3.042、黑曲霉3.350、根霉3.010三种霉菌以3∶2∶0.5比例在36℃进行混合制曲48 h，此曲酶系丰富，酶活力高，其中蛋白酶、淀粉酶、纤维酶分别达到3 830 U/g、630 U/g、1 800 U/g。顾立众［32］以豆粕和小麦为主要原料，采用固态低盐原池淋浇发酵法生产基础酱油，对基础酱油使用根霉酯化酶进行增香，试验结果表明：添加根霉酯化酶能显著提高基础酱油中挥发酯的含量，使酱油滋味醇厚，香气浓郁。蒋予箭等［33］对母子酱油发酵酱醅中霉菌的菌相组成进行了分析，结果表明，母子酱油发酵酱醅中米曲霉占优势菌群，另有根霉、黑曲霉、毛霉、青霉和葡萄孢霉。

2 根霉在环境科学的应用及其在食品工业中的安全性

2.1 废物利用方面的应用

近几年研究表明根霉在废物再利用上也充当重要的角色。López等［34］用固定化米根霉发酵四种食品加工废物大麦麸皮、米糠以及花生和核桃废物生产脂肪酸，结果表明大麦麸皮因具足够的物理完整性，以及工艺成本低的特点而成为最佳选择。Balasubramaniam等［35］利用固定化米根霉262全细胞脂肪酶和商业化纯脂肪酶发酵地沟油（葵花籽油）产脂肪酸烷基酯，结果显示，全细胞生物催化剂和纯脂肪酶将甘油三酸酯转化为脂肪酸烷基酯的转换率分别达到84%和94%。滕云等［36］用华根霉Y92-M全细胞脂肪酶在无机溶剂体系中催化地沟油合成生物柴油，转化地沟油的转化率高达80%。

2.2 在餐饮及造纸废水方面的应用

利用微生物有效解决环境上的问题已成为众学者的一个重要研究方向。人们对根霉在这方面的研究虽不够深入，但已取得初步成效。目前，我国大多数餐饮废水未经处理直接排放倒水里，给环境造成严重的污染。吴福安等［37］用米根霉TY GFI菌株降解大豆油脂废水，其最高降解率达95.6%，这对环境净化和水循环利用具有十分重要的意义。此外，我国造纸废水产生的活性污泥的无害化处理与处置已成为亟待解决的环境问题。张建云等［38］用根霉对造纸废水产生的二级生化处理污泥发酵产乳酸，优化条件下，乳酸最高产量达3.1 g/L；张亚娟［39］用黑根霉菌对Cd2+、Cr6+、Pb2+等重金属离子进行吸附试验，结果表明，黑根霉菌的吸附过程符合Langmuir 吸附模式，对Cd2+、Cr6+、Pb2+具有较高吸附能力，通过Langmuir公式得出Cd2+、Cr6+、Pb2+的Qmax（最大吸附量）分别为52 mg/g、14 mg/g和37.3 mg/g。

2.3 在食品工业中的安全性问题

在食品工业中，工业用菌不仅要考虑其优良的生产特性，其安全性也至关重要。但目前国内外对根霉的研究多集中在其工艺条件的优化及其发酵产物在工业上的应用。国内对根霉菌安全性问题的研究极少，仅王立群、董明盛等［40，41］采用动物毒理试验对丹贝的安全性进行了检测。结果表明，急性经口试验LD50>15.0 g/kg体重；精母细胞染色体畸变试验、微核试验、精子畸形试验和Ames试验均为阴性，铅、砷、ABF1含量均在安全标准以下，证明丹贝是安全食品。

然而，国外有报道用从丹贝中分离的根霉菌发酵制作丹贝时产生了毒素［42］。据相关报道，从根霉菌发酵产物中分离得到的rhizonins 和rhizoxins 可能会造成食品安全问题，它们是两类在结构上相似的系列化学物质。但有研究表明，rhizonins并不是由根霉菌代谢产生的，而是根霉菌中的内共生菌产生的［43］。rhizonins是从霉烂的花生中分离出来的一株小孢根霉（R.mcrosporus），是由Steyn等［44］发现于南非莫桑比克，也是最早报道的从接合菌中分离得到的毒素。在经过质谱、核磁共振光谱、氨基酸分析和X晶体衍射等的分析后，得出rhizonins是由7个稀有氨基酸构成的环肽化合物，因其有一基团不同而分为rhizonins A和rhizonins B两种。可能由于rhizonins A是其中主要产物，所以之后的一些研究多集中于rhizonins A。近几年国内外专家对rhizonins A的研究较少。Nakatsuka等［45］对其构效关系进行的研究表明，呋喃结构可能是rhizonins A对脂肪细胞存在潜在毒性的原因。动物试验结果表明，rhizonins A及其产生菌均具肝毒性，可导致急性或慢性的肝衰竭而致死。Wilson等［46］在日龄还未能分辨雌雄的北京雏鸭饲料中分别添加由25种根霉和毛霉发酵的玉米培养物，添加量均为50%（W/W），结果导致了鸭的死亡；将其中一株小孢根霉菌用于产rhizonins A，并将所产的rhizonins A经纯化后灌胃部分自交系雄性小白鼠，结果表明，LD100小于70 mg/kg。经光学显微镜观察评估，饲喂玉米培养物的小鼠的肝脏和肾脏病变状况与灌胃rhizonins A的鼠相似，肝细胞表现出变性到坏死等程度不一的变化，肝组织结构解离，并向汇管区扩散。

Rhizoxins是从根霉菌发酵产物中分离的另一种次级代谢产物。Iwasaki等［47］首先从华根霉（R.chinensis）培养物中分离纯化得到毒性代谢产物，将其命名为rhizoxins（1），并利用紫外、红外、质谱及核磁共振等技术研究了其分子结构，推断出其基本结构。Taakahshi和Jian等［48，49］的研究结果表明，rhizoxins是一类大环内酯化合物，是由16个原子组成的大环结构、环氧结构、内酯结构和侧链结构。该类化合物中的8种结构类似物的主要不同点在于其2 个环氧结构的位置和17位碳原子上的取代基团。生物学研究表明，rhizoxins有明显细胞毒性。Kiyoto和Tsuruo等［50，51］用动物毒理试验对rhizoxins的毒性进行了检验，结果表明：对小鼠腹腔注射LD502.5 mg/kg，静脉注射的LD50为5-10 mg/kg，毒性表现为体重减轻或生长迟缓、饮水或摄食减少、腹泻、轻度白细胞和血小板减少、后肢麻痹等。

由此可见，根霉菌在食品中是一种益、害兼有的真菌，可是目前国内在食品工业应用中却极少关注其潜在危害。从上可知根霉菌的某些种（报道的有小孢根霉、 华根霉和米根霉等）的发酵产物中有rhizonins 和 rhizoxins。根霉菌种在腐乳或丹贝的前发酵时期能在基质上产生rhizoxins，可能会带来食品安全问题。因此，要加强对根霉菌种代谢产物中的rhizonins 和 rhizoxins 的分析研究工作，应该重新审视我国以根霉菌为优势菌群的自然发酵和纯种发酵食品的安全性。

3 结语

根霉菌是应用非常广泛的工业用菌，目前我国对根霉的研究工作多集中于优良菌株的分离选育及改善环境条件提高根霉有益代谢产物量方面。未对我国传统发酵食品和传统发酵曲中根霉种质资源进行过系统调查，对其代谢产物的研究也欠深入，尤其是有毒代谢产物分析。因此对根霉的研究方向：一方面，探寻潜在的不产毒素，产糖化酶、脂肪酶、L-乳酸、L-苹果酸、富马酸等代谢产物的优质根霉菌种；另一方面，着重比对发酵产物和不同根霉种间基因差异，建立根霉基因与代谢产物之间关联，为根霉基因育种提供有价值的依据。

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