非生物及生物胁迫下脱水蛋白的研究进展

代瑾然 叶辉 陈穗云

（1.云南大学生命科学学院植物科学研究所，昆明 650091；2 云南大学农学院，昆明 650091）

1989年，Close等［1］从ABA处理的大麦胡粉粒和干旱处理的玉米幼苗中分离到4个干旱诱导蛋白，将其命名为脱水蛋白。脱水蛋白是胚胎发育晚期富集蛋白（Late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白）家族成员，属于第2组，也称D-II或RAB（Responsive to abscisic acid）［2］。脱水蛋白，顾名思义，是一类在植物细胞遭受水分胁迫时大量富集的蛋白质。脱水蛋白分子量从9-200 kD不等，富含亲水性、带电荷和极性氨基酸，通常不含色氨酸和半胱氨酸，富含甘氨酸，基于这个特征，脱水蛋白也属于亲水素（Hydrophilins）蛋白家族［3］。脱水蛋白的特征（保守）序列是一段叫做K片段（K-segment）的多肽［4，5］。所有脱水蛋白中都存在至少一个K片段。K片段通常位于C端，富含赖氨酸，特征序列是：EKKGIME/DKIKEKLPG，数目从1-11个不等，可以形成兼性α-螺旋。脱水蛋白中还含有其他保守基序，如位于N端的富酪氨酸的Y片段，保守序列为（V/T）D（E/Q）YGNP。此外，还含有一个富丝氨酸的S片段（4-10个丝氨酸残基组成），保守序列为LHRSGS4-10（E/D）3。S片段可以被酪蛋白激酶2（CK2）磷酸化［6］。根据脱水蛋白中这3个保守序列的组成和数目不同，可以将脱水蛋白分为5个亚类 ：Kn、SKn、KnS、YnKn 和 YnSKn［4］。亚细胞定位试验表明：在细胞质、细胞核、质膜、线粒体和液泡中均检测到脱水蛋白，不过大多数脱水蛋白通常定位于细胞质和细胞核［7］。脱水蛋白广泛存在于裸子植物和被子植物中，在其他可进行光合作用的生物，包括蕨类、苔藓、藻类和蓝藻中也存在脱水蛋白［5］。

1 无序结构的脱水蛋白

缺乏有序的高级结构是脱水蛋白最基本的生化特征之一。早期研究对脱水蛋白时已经意识到脱水蛋白的无序性特征。脱水蛋白富含甘氨酸、带电荷氨基酸和极性氨基酸。大部分脱水蛋白不含有半胱氨酸残基或其他疏水结构域。最初将脱水蛋白归类于无序蛋白也是基于这个结构特征。事实上，利用圆二色谱分析了植物材料分离的脱水蛋白和体外重组的脱水蛋白，均验证了脱水蛋白的无序性［8-11］。

脱水蛋白以无序卷曲的形式存在于水溶液中。它们与周围水分子最大程度形成分子间氢键，同时不同的氨基酸残基间最小程度的形成分子内氢键。由于分子间氢键比例较小，脱水蛋白表现出无序性，同时还表现其他无序蛋白的共有性质，如SDSPAGE电泳迁移率较小，对蛋白酶高度敏感，1HNMR光谱色散位移较小［11，12］。由于脱水蛋白富含亲水的和带电荷的氨基酸，可以根据所处微环境的变化改变其构象。利用远紫外圆二色谱法（Far-UV circular dichroism）检测到脱水蛋白微环境中水分子丧失，或者在水溶液中添加高浓度的亲和溶质（如甘油）、去垢剂（如SDS）、盐分（如NaCl）都会导致脱水蛋白构象改变［11，13］。当水分减少时，K片段形成类似于阿朴脂蛋白和α-核蛋白结构类似的A2型两性α-螺旋。当K片段形成α-螺旋时，带负电荷的氨基酸（酸性等电点氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸）处于螺旋的一侧，同时疏水氨基酸（非极性氨基酸，如异亮氨酸和亮氨酸）位于螺旋的另一侧；而带正电荷的氨基酸（碱性等电点氨基酸：如赖氨酸和精氨酸）则位于极性-非极性接触面［14］。

无序蛋白构象改变导致功能改变的特有现象叫做“兼职”（Moonlighting）［12，15］。对于无序蛋白而言，所处微环境的改变，诸如可利用水分子的减少会导致其蛋白构象和功能改变。双亲性的α-螺旋可以与许多蛋白或生物膜疏水表面互作。Ingram和Bartels［16］提出假说：当存在α-螺旋构象时，脱水蛋白中的K片段可以形成束（bundle），由此增强了它们与蛋白质或生物膜的相互作用。脱水蛋白与其他蛋白疏水表面的结合促进α-螺旋形成，保护或阻止蛋白质进一步失水，从而避免蛋白构象的不可逆改变，阻止蛋白发生变性。现在认为脱水蛋白与其他蛋白或生物膜的互作是脱水蛋白的基本保护功能之一。

高温处理也是导致蛋白质变性的因子之一，体外实验表明，拟南芥ERD10和ERD14可以阻止高温诱导的蛋白聚集，帮助多个酶在高温处理后保持活性，如溶菌酶、乙醇脱氢酶、萤火虫荧光素酶和柠檬酸合酶［11］。高温处理β-葡糖苷酶（bglG）和葡萄糖氧化酶（GOD/POD）会造成失活，而利用重组纯化的小麦DHN-5能保护和稳定热处理后两个酶的活性［17］。植物体内存在一些四级结构的复合酶，低温或水分胁迫下，复合酶各亚基间氢键遭到破坏，疏水残基外翻，四聚体解聚，天然构象改变；形成非天然状态的混合四聚体，造成酶活性的丧失［18］。而脱水蛋白中大量的亲水氨基酸能有效补偿和替换由于水分缺失造成的蛋白表面氢键破坏，帮助维持蛋白的构象。此外，脱水蛋白中的无序结构所具有的高亲水性和带电性阻止了其他分子与蛋白外翻疏水区的结合，有利于目标蛋白分子的重折叠。细胞内除L-乳酸脱氢酶外，还有许多重要酶类，如苹果酸脱氢酶、呼吸链中的多种多亚基复合酶，其酶活性都与细胞中含水量相关。水分缺失会引起天然构象的改变和酶活性丧失。同时细胞中存在像脱水蛋白这样一些无序的和高度亲水的小蛋白，能帮助那些受水分胁迫发生构象改变而失活的蛋白质或酶类稳定构象和恢复活性。虽然目前对脱水蛋白，甚至是LEA蛋白家族其他成员抗冻保护的具体机制还不是很了解，但Reyes等［19］的试验证明K片段是脱水蛋白发挥抗冻保护能力所必须的，以拟南芥ERD10为例，AtERD10含有1个S片段和3个K片段，缺失最后一个K片段，对保护作用影响不大，但是缺失全部K片段，对L-乳酸脱氢酶的保护能力下降。

脱水蛋白在高温或冷冻刺激后帮助蛋白维持正确折叠或防止聚集的作用类似于分子伴侣。但是，典型的分子伴侣不仅可以防止蛋白的不正确折叠，同时还能通过其疏水片层结构与目标蛋白形成复合体［20］。但是脱水蛋白与蛋白质或是生物膜的结合是非特异的，它们的保护功能是广泛而没有偏好性的，很难说脱水蛋白特异的与某些蛋白质形成复合体。因此，有些作者将脱水蛋白非特异的保护功能定义为分子盾（molecular shield）［21］。此外，当细胞失水时，细胞内含物的相对位置和分布会发生改变，导致蛋白-蛋白复合物或蛋白-生物膜复合物错误的互作、聚集和变性。正常生活环境中的细胞内各组分、各区室维持一定的相对距离，互不干扰；而细胞失水时，这些错误聚集的复合物在细胞各区室大量积累，占据很大的空间，脱水蛋白可能发挥“空间填充物（Space Fillers）”的作用，参与维持细胞内各组分间初始的，非伤害性的相对距离［21，22］。简单地说，由于脱水蛋白的无序性，它们可以非特异的结合生物大分子。同时，其高亲水性又能帮助它们大量结合水分子。因此，在细胞失水时，脱水蛋白可以帮助维持细胞初始形态，避免细胞过度失水而坍塌［23］。

2 与大分子结合的脱水蛋白

Close［4］及其研究团队推测脱水蛋白可以与生物大分子结合。他们的推测主要是基于脱水蛋白中高度保守结构基元——K片段。K片段可以形成双亲性α-螺旋，这个螺旋可以与大分子结合。利用去垢剂，可以从膜碎片小泡中分离到脱水蛋白［24，25］，表明有一些脱水蛋白可能是与膜结合的。Koag等［26］第一次直接证明脱水蛋白可以与脂囊泡结合。玉米的DHN1可以与含有酸性磷脂质，如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酸的囊泡结合，但不与含有磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的囊泡结合。磷脂酸小泡增加了DHN1的螺旋性。他还发现脱水蛋白与酸性磷酸脂囊泡的结合需要K片段的参与，同时酸性磷酸脂囊泡也会促进DHN1脱水蛋白K片段的螺旋化。拟南芥ERD10和ERD14可与酸性磷酸脂囊泡结合［13］。但与磷酸脂结合几乎未改变脱水蛋白的二级结构。由于脱水蛋白特异与酸性磷酸脂结合，表明脱水蛋白在细胞内，可能与膜系统的特定区域互作。

核酸也是脱水蛋白潜在的目标大分子，位于氨基端的Y-片段（DEYGNP或相似序列）可能含有核酸结合结构域。生物信息学软件POPP（蛋白/核酸可能功能性分析）分析结果表明脱水蛋白可以与 DNA 结合［27］。Hara等［28］报道柑橘脱水蛋白CuCOR5具有锌离子依赖的核酸结合功能。CuCOR15与核酸的结合是非特异的，因为CuCOR15可以同时结合序列相关性较差的DNA或RNA。CuCOR15的DNA结合结构域是一段富组氨酸序列（TTDVHHQQQYHGGEH）和一段富赖氨酸片段（GGEGAHGEEKKKKKKEKKK）。富组氨酸序列主要的功能是结合金属离子［29］，组氨酸与CuCOR15和金属结合相关，因此这两个DNA结合结构域中的组氨酸残基可能参与了锌离子依赖的核酸结合。虽然，富组氨酸结构域和多聚赖氨酸序列不是脱水蛋白的保守序列，部分脱水蛋白中还是含有这两个结构域，表明脱水蛋白可能具有与核酸结合的潜在能力。然而，保守的K片段却不具备与DNA结合的能力，表明与核酸的结合不是脱水蛋白的保守功能。

利用哺乳动物纤维母细胞筛选系统的研究表明拟南芥ERD10与COR47是与细胞骨架互作的蛋白［30］。ERD10可以直接与肌动蛋白微丝结合，抑制肌动蛋白聚合。在烟草叶片中，ERD10可以保护肌动蛋白细胞骨架免遭微丝抑制剂拉春库林造成的破坏。但是，与肌动蛋白结合的结构域没有得到进一步的研究。磷脂质，核酸和细胞骨架这一类的大分子是细胞遭受胁迫时比较敏感的大分子。对脱水蛋白的研究表明，与这些大分子的结合可能是脱水蛋白在植物细胞遭受胁迫时发挥保护功能的关键。

3 与小分子结合的脱水蛋白

金属离子可能是脱水蛋白常见的一个目标。水分胁迫可能引起从细胞器或膜上释放金属离子，从而导致细胞内自由金属离子浓度增大。而脱水蛋白与金属离子的结合可以减轻由自由离子造成的伤害。这个假说在转基因烟草中得到验证，过表达芸薹脱水蛋白BjDHN2和BjDNH3的转基因烟草与对照相比都有较强的金属耐受性［31］。

很多研究表明脱水蛋白可以与钙离子结合。与钙离子的结合通常伴随着蛋白质的磷酸化。分离得到的玉米胚的Rab17蛋白是磷酸化形式的，这是第一次报道脱水蛋白的磷酸化［32］。芹菜液泡关联脱水蛋白样蛋白（VCaB45）［25］，拟南芥脱水蛋白（ERD10，ERD14 和 COR47）［24，33］和 复 苏 植 物 脱 水 蛋 白（CDeT6-19）［34］都可以检测到磷酸化形式。主要的磷酸化位点位于S片段（LHRSGSSSSSSSEDD或相似序列）［24，32，33，35］。以 Rab17 为例，其 S 片段对于Rab17的核定位是必需的，Rab17蛋白在核里以磷酸化形式存在［6，36］。Heyen 等［25］第一次报道了钙结合依赖的脱水蛋白磷酸化。磷酸化的芹菜脱水蛋白VCaB45可以与钙离子结合，而去磷酸化的脱水蛋白不能与钙离子结合，表明脱水蛋白的磷酸化激活了与钙离子结合的活性。在ERD10、ERD14和COR47中也观察到相似的结果。有趣的是，这4个脱水蛋白都是酸性脱水蛋白。同时，中性脱水蛋白RAB18即使在磷酸化状态下，也不能与钙离子结合［33］。虽然到目前为止还没有从任何酸性脱水蛋白中分离到钙离子结合区域，预测钙离子结合区域不是S片段而是位于S片段上游。这4个酸性脱水蛋白的钙离子结合能力，表明脱水蛋白可以发挥离子缓冲成分或钙离子依赖的分子伴侣功能。当然，这些功能还需要进一步的验证。

二价金属离子，如锌、锰、镍和铜离子能抑制酸性脱水蛋白与钙离子的结合，表明这些金属与脱水蛋白结合的位点也是与钙离子结合的位点。酸性脱水蛋白与钙离子结合的一个显著特征是酸性脱水蛋白必须被磷酸化［33］。而其他二价金属离子与非磷酸化的脱水蛋白结合。拟南芥脱水蛋白Rab18、ERD10、Xero2 和 COR47［37］，蓖麻 ITP［38］和柑橘CuCOR15［27］与金属螯合组分一起沉淀。因这些蛋白与金属离子结合是非磷酸化状态，因此其与酸性脱水蛋白与钙离子的结合机理不同。组氨酸残基在脱水蛋白与金属离子结合过程中发挥重要的功能，因为与金属螯合组分一起沉淀的脱水蛋白可通过咪唑缓冲液进行洗脱。CuCOR15表现出很高的铜离子结合能力，可以结合16个铜离子。非磷酸化的CuCOR15可以结合铜离子但是却不能结合钙离子。对CuCOR15不同结构域的分析表明，富组氨酸区（HKGEHHSGDHH）是主要的金属离子结合位点［29］。

组氨酸残基可以结合金属离子，含组氨酸相关序列，尤其是His-X3-His和His-His也表现出很强的金属离子亲和力［29］。值得注意的是，许多金属离子转运子常含有富组氨酸结构域，如富组氨酸环，这个结构域可以调控转运子的功能［39，40］。细胞里的脱水蛋白可能发挥离子缓冲和/或离子感知的功能。

各种逆境胁迫还会引起活性氧的积累。活性氧首先是对生物膜系统造成损伤，导致细胞膜过氧化，超氧化物歧化酶和其他清除自由基的酶类活力下降，同时产生大量的膜脂过氧化产物，破坏膜脂的完整性和稳定性；膜系统的破坏会引起一系列生理生化紊乱。其次是对生物大分子如蛋白质的氧化损伤，蛋白羰基化作用是不可逆的氧化过程；活性氧同样能损伤DNA，DNA对自由基的攻击是十分敏感的，活性氧诱导DNA裂解、缺失突变或发生其他致死突变，最终导致DNA的断裂。逆境胁迫造成体内积累过多的活性氧，植物受到严重的损伤，如果胁迫强度增大，或时间延长的话会导致植物的死亡［41］。脱水蛋白具有与活性氧分子结合的能力，对柑橘CuCOR19蛋白的研究表明，CuCOR19蛋白能特异结合羟基自由基和过氧化自由基的能力，羟基自由基作用的靶位点主要是Gly、His和Lys，而脱水蛋白中富含这些氨基酸，因此脱水蛋白可能在活性氧爆发的情况下通过自我牺牲的方式消耗活性氧从而保护其它蛋白质免受损伤［42］。

脱水蛋白还可以与水分子结合。质子核磁共振和差式扫描量热法测量表明，ERD10可以与大量水分子和带电荷离子结合［43］。研究表明，ERD10可能在水分胁迫细胞中维持水分，从而保护蛋白在细胞内离子平衡打破时不发生变性。

4 参与生物胁迫的脱水蛋白

脱水蛋白的抗冻保护能力、结合膜脂和核酸、结合离子或水分子的功能主要是研究脱水蛋白与非生物胁迫过程中发现的，同时不同的研究小组还发现，水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）却可诱导特殊的脱水蛋白如厚叶旋蒴苣苔的BcDh2表达［44］。值得注意的是，SA和JA通常与植物抗生物胁迫相关。另一方面，Turco等［45］发现，在抗旱栎树Quercus ilex受到疫霉菌Phytophthora cinnamomi侵染时，会表达若干个类脱水蛋白。这些试验结果均表明，除了参与水分胁迫外，脱水蛋白还可能与生物胁迫相关。

新近研究发现植物脱水蛋白的代表——小麦脱水蛋白DHN-5异源表达于拟南芥中时，不仅可以帮助植物抗水分胁迫，还具有多重抗胁迫功能［46］。转录组测序结果表明，DHN-5的异源过表达不仅影响了与非生物胁迫相关的基因（如LEA，RD29，RAB18和Lit30）的表达，还影响了与生物胁迫相关基因的表达。与野生型相比，DHN-5过表达拟南芥中植物诱导抗病性标记基因——病程相关蛋白（Pathogenesis related protein family，PR）家族的PR1、PR13和PR14的转录分别上调2、2.6和3.38倍；其他两个编码几丁质酶的基因的表达也上调2.26和2.47倍。更有趣的是，DHN-5异源过表达还影响了茉莉酸（JA）信号通路。茉莉酸ZIM结构域（JAZ）家族三个成员，JAZ10、JAZ7和JAZ5均下调表达2.5至10倍不等。JAZ蛋白是JA信号通路的负调控子，未受到外界胁迫时，JAZ蛋白与转录因子MYC2结合，MYC2处于失活状态；当受到环境胁迫时，植物体内合成足够的JA，导致26S 蛋白酶体降解JAZ，释放MYC2，从而启动茉莉酸响应基因的表达［47］。然而，DHN-5转基因株与野生型相比更加耐受JA的处理。DHN-5转基因株表现出与JA不敏感突变体jai3-1（jai3-1影响了JAZ蛋白的降解，从而干扰了MYC2转录因子调控的JA响应基因的表达）相似的表型，JA处理后，与野生型相比，受MYC2转录因子调控的伤害响应基因的表达出现不同程度的减弱，而病原菌应答基因PR1和PDF1.2则上调表达。MYC2转录因子双重调节JA信号通路的两条支路：病原菌应答或是伤害应答。在这个双重调节系统中，MYC2抑制病原菌响应基因（如PR1和PDF1.2）的表达而激活伤害响应基因（如VSP2和LOX3）的表达。由于JA非敏感突变体jai3-1中MYC2依赖的JA响应基因表达受阻，因此推断在DHN-5过表达植株中，MYC2依赖的基因的表达同样受抑制，因此表现出与jai3-1相似的表型，对JA处理不敏感（或敏感性降低）。换句话说，DHN-5可能部分影响了MYC2的功能，导致PR1和PDF1.2的高表达和VSP2和LOX3的减弱。此外DHN-5过表达植株中下调表达的JAZ10、JAZ7 和JAZ5是受MYC2转录因子正调控的。这些结果表明DHN-5可能干扰了MYC2依赖的基因表达，导致JA响应基因的表达发生改变。考虑到JA是病原菌抵御网络中重要的信号分子，因此探讨DHN-5是否可以通过改变MYC2依赖的JA响应基因的表达来调控植物抵抗病原菌是很有意义的。

此外，拟南芥SK3型ERD10基因在细菌中的表达会抑制细菌的生长，这个抑制作用与K片段相关。另一个SK3型水稻脱水蛋白RR46也具有类似的抑制作用，除了大肠杆菌，RR46还能抑制一系列革兰氏阳性细菌的生长，如短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌［48］。有趣的是，人工合成的K片段（如KKKKGLKEKIKEKLPGHK）对部分革兰氏阳性细菌仍然具有抑制作用，可能的原因是K片段中的部分氨基酸，在某种特定情况下形成跨膜结构，而这个跨膜结构可以与细菌细胞膜结合，造成细菌生长受抑制。依据DHN的抗细菌能力，可以大胆假设某些DHN可以抑制病原菌的生长，从而间接提高植物的抗病性。

5 展望

脱水蛋白在非生物胁迫过程中发挥重要作用，具有多种功能。有些脱水蛋白可能同时发挥多种功能，而一些脱水蛋白只能发挥单一功能。因此有必要弄清哪些功能是全部脱水蛋白都具有的，哪些功能是某些特殊脱水蛋白具有的。到目前为止，结合酸性磷酸脂、离子和抗冻保护能力被认为是脱水蛋白的基本功能。由于脱水蛋白是无序蛋白，在生理环境下，功能结构域或序列可以发挥功能而不会受到结构限制。因此，结构域研究能有效揭示这些功能发挥的机理。如果阐明了功能与结构域的关联，那么就可以从结构域组成上去解释脱水蛋白的功能。此外，脱水蛋白可能还参与了生物胁迫应答过程。某些脱水蛋白可能在生物胁迫和非生物胁迫信号交叉过程中扮演重要的调控作用。在水分不足的时期，一些投机取巧的细菌会乘机侵染植物，而在进化过程中，一些脱水蛋白被选中，作为植物防御系统的一部分，同时发挥抵抗水分胁迫和细菌侵染的功能。因此，即使在基础生物防御系统不起作用时，这些脱水蛋白通过它们的抗细菌活性仍能减轻生物胁迫对植物造成的伤害。逆境胁迫和病害是影响植物生长发育的一个重要因素，深入研究脱水蛋白在非生物胁迫和生物胁迫中发挥的确切功能不仅有助于更全面的了解植物应对逆境胁迫的机制，还能为开发脱水蛋白在作物改良中的应用奠定理论基础。

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