RNAi靶向沉默c－FLIP(L)基因对大肠癌细胞凋亡的影响

杜亚平 张泽富 忽景泰 吴怀敏 谢建军

1.广东省珠海市第二人民医院消化内科 519020 2.中山大学第五医院影像科 广东珠海 519000 3.广东省珠海市第二人民医院呼吸内科 519020

大肠癌是严重影响人类生存的常见恶性肿瘤之一，目前治疗主要以手术为主辅以放疗和细胞毒性药物化疗，但还有半数的病人死于再发和转移［1］。通过RNAi的技术将C－FLIP的siRNA片段对大肠癌凋亡的影响，探究RNAi的靶向沉默C－FLIP基因在TRAIL介导的凋亡途径中的作用机理，并期望使之成为大肠癌治疗的新手段。

资料与方法

细胞株与试剂:人卵大肠癌细胞株，以及各实验所需相关试剂。

实验方法:①细胞实验:用电穿孔技术把c－FLIP(L)对应的SiRNA片段转染入细胞，半定量RT－PCR法判断干扰前后FLIP mRNA水平的变化，Western blot分析FLIP蛋白水平变化，比较对应不同位点的两个片段对的干扰效果经凋亡诱导型杭体激活后，以染色法及降解片段检测分析干扰前后细胞对介导的凋亡敏感性的改变。四甲基偶氮唑盐(MTT)法及流式细胞术(FCM)检测c－FLIP(L)－siRNA转染前后TRAIL对SW480细胞生长抑制作用的变化。以Annexin－V－PI双染法流式细胞术(FCM)比较c－FLIP(L)－siRNA转染前后TRAIL诱导的细胞凋亡的情况。②动物实验:通过构建脂质体介导的c－FLIP(L)－siRNA在脂质体(LipofectamineTm2000)介导下转染大肠癌裸鼠移植瘤模型，将其分组。观察c－FLIP(L)－siRNA对大肠癌裸鼠移植瘤的作用。具体方法，见图1。

图1 实验方案流程图

实验分组:未做任何处理的大肠癌胞株SW480为空白组;转染脂质体Lipofectamine2000的SW480细胞脂质体组;转染NC－siRNA的SW480为阴性对照组;转染c－FLIP(L)－SiRNA的SW480是FLIPL组。

统计学处理:应用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析处理，计量资料采用t检验，计数资料采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

具体结果，见表1。

表1 转染c－FLIP(L)－SiRNA后TRAIL对SW480胞株的凋亡作用

讨 论

目前该大肠癌基因研究主要包括免疫基因治疗、自杀基因治疗、癌基因和抑癌基因的基因治疗、抗癌血管生成基因治疗、改善肿瘤化疗疗效的基因治疗和联合治疗等［2］。现如今对大肠癌尚无肯定的基因治疗方法，利用RNAi技术将c－FLIP(L)对应的SiRNA片段对大肠癌细胞株SW480凋亡的影响，明确RNAi靶向沉默c－FLIP基因在TRAIL介导的凋亡途径中的作用，来指导临床治疗。

FLIP作为一种重要的凋亡抑制蛋白，可通过抑制caspase－8的活化来阻断死亡受体通路，发挥凋亡抑制效应。C－FLIP与肿瘤的发生发展密切相关，阻断caspase蛋白酶级联反应，从而抑制Fas、TNFR－1、DR5、TRAILR 等死亡受体介导的凋亡。c－FLIP对由代谢抑制剂引起的翻译受阻具有高度的敏感性。c－FLIP特异的代谢抑制剂处理后，可减小癌细胞的生存能力，提高其死亡率。以治疗c－FLIP蛋白过表达的致命疾病随着对c－FLIP分子调节机制的深入研究，以c－FLIP或其调节分子为靶点，对肿瘤及自身免疫性疾病进行基因治疗研究，有了更为广阔的前景。

1 白玉贤，刘磊，隋红，等.miRNA干扰Pokemon基因对大肠癌细胞增殖的影响及机制［J］.临床肿瘤学杂志，2011，16(11):970 ～973.

2 张孟贤，韩娜，于世英.RNA干扰沉默HDAC1基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响［J］.世界华人消化杂志，2008，16(11):1173－1178.