P57Kip2、CDK5在维甲酸致神经管发育缺陷模型中基因表达差异＊

李新军，韩杨云，徐 宏△，杨 忠，曾 义，孙中书，李红丽，龙晓东，游 潮

（1.四川省德阳市人民医院神经外科 618000；2.第三军医大学神经生物教研室，重庆 400038；3.四川省人民医院神经外科，成都 610041；4.四川大学华西医院神经外科，成都 610041）

神经管缺陷（neural tube defects，NTD），在所有的新生儿缺陷中发病率居第一位，是在胚胎发育过程中由于神经管闭合不全引起的一种缺陷［1］。基因芯片指将许多特定的寡核苷酸或基因片段作为探针有规律地排列固定于支持物上，样品RNA经同位素或荧光标志后进行杂交，应用计算机系统对杂交信号检测分析，从而得出相应的生物信息。基因芯片技术的应用为在分子水平研究复杂的生理病理过程或信号通路提供了迄今最有力的工具。由于NTD基因表达及调控过程复杂多变，国内外研究较少。P57kip2、蛋白激酶5（CDK5）作为重要的细胞周期相关因子在神经系统发育中的作用机制尚不十分清楚。本课题组通过动物实验和基因芯片分析，比较了胚胎9.5、10.5d正常与同期NTD小鼠神经管组织的P57kip2、CDK5的基因表达差异，并对其进行杂交验证。以求发现二者与NTD发生和神经胚的密切联系，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 120只成年昆明种小鼠，鼠龄55～65d，体质量22～28g，无特异病原体，雌雄各半，由第三军医大学实验动物中心提供（动物质量合格证号：SCXK（渝）2007003）。实验中对动物处置方法符合动物伦理学要求。

1.2 主要实验试剂和仪器 TRIZOL试剂、SuperScriptⅡ逆转录酶、OligodT12－18随机引物、Rnase抑制剂购自 Gibco－BRL公司；维甲酸（RA）购自美国Sigma公司；5×缓冲液，dATP、DCTP、dGTP、dTTP，0.1MDTT，Poly dA，Yeast tRNA，CoT－1DNA 购自美国 Life technology公司；Cy5－dUTP、Cy3－dUTP购自香港 Amersham pharmacia公司；32P－dCTP购自美国Beckman公司；QIAquick质粒纯化试剂盒，QIAquick探针纯化试剂盒购自美国Gene公司；基因微点阵购自香港Amersham Pharmacia公司；1%琼脂糖甲醛变性凝胶、MOPS缓冲液、10×MOPS缓冲液、10%SDS缓冲液等溶液按《分子克隆》方法配制，药品试剂为国产分析纯级。基因序列购自美国Incyte公司小鼠基因文库。ScanArray4000芯片扫描仪购自美国General Scanning公司；ScanAlyze2.51软件购自美国斯坦福大学；Microcon YM－30为Millipore产品。

1.3 方法

1.3.1 神经管发育缺陷模型建立及分组 120只成年昆明种小鼠，于下午6：00按雌雄各半比例合笼，次日清晨8：00取出，检查雌鼠阴道口有无阴栓，共获得60只孕鼠。将有阴栓者当日早晨8：00定为孕期第0天（embryonic，E0d），下午4：00定为E0.5d。按Klootwijk等［2］的方法制备NTD模型。RA处理致NTD小鼠RA溶于玉米油内，按50mg／kg于孕期E7.0d～7.25d时一次性喂服孕鼠，造成NTD模型（RA诱导组，n＝30）。同时正常对照组（n＝30）喂服等量玉米油。

1.3.2 标本采集 两组小鼠在孕期为E9.5d（n＝16）、E 10.5d（n＝12）时，颈椎脱臼法处死，取出孕鼠子宫并分离胎盘、胎膜组织，在解剖显微镜下确定RA组已造成NTD发生。挑选典型的异常神经管组织来进行总RNA的分离和提取。

1.3.3 总RNA的提取与检测 按Gibco－BRL公司TRIZOL试剂所提供的方法进行，分光光度仪检测RNA标本浓度，最后按约3.3μg／μL的浓度进行稀释分装，每管15μL（50μg），－80℃保存。

1.3.4 基因芯片杂交与扫描分析 （1）逆转录（RT）标记反应：Mix＃1（×2，两组RNA标本），总RNA（50μg）15μL，OligodT12－18primer（0.5mg／mL）4μL，Rnase inhibitor 1μL，共20μL，混合后70℃孵育10min，置冰上10min。Mix＃2：5×缓冲液16μL，10 ×low T dNTPs 8μL，0.1mmol／L DTT 8μL，SuperScriptⅡ4μL，共36mL DNA合成：分别加18μL RT反应体系（Mix＃2）到两组Mix＃1，再分别在两组标本加2μL Cy3－dUTP（正常对照组）或 Cy5－dUTP（RA 诱导组），42℃孵 育，2h。10 × low T dNTPs：100mmol／L dATP、dCTP、dGTP各30μL，100mmol／L dTTP 6μL，加 DEPC水504μL，混匀。（2）水解、洗涤纯化：加10μL 0.5mol／L NaOH（含100mmol／L EDTA），混匀后，65℃孵育，10min，终止反应；加10μL 0.5mol／L HCl（1mol／L Tris，pH 7.4），混匀。将cy3和cy5标记标本混合于 Microcon YM－30管中，12000r／min离心约5min，再加500mL TE缓冲液（pH 8.0），离心洗涤2次。弃洗涤液（含未反应完物质及小分子片段等）。将YM－30管倒置于一新的EPENDOFF管，低速离心收集含cy3、cy5标记的cDNA片段，最后液体量约20μL。（3）芯片杂交每个杂交体系加：Poly dA（8mg／mL），Yeast tRNA（4mg／mL），CoT－1DNA（10mg／mL）的等份混合物 3μL。20×SSC 3μL，10%SDS 0.4μL。总杂交液体积约20～30μL（1cm×2cm芯片面积），100℃变性后，混匀，小心滴在基因芯片上，加盖片，在湿盒中65℃孵育，16～24h。将玻片浸于2×SSC，0.1%SDS缓冲液中，37℃10min，振荡使盖片滑落，重复洗涤1次，15min。甩掉液体，1×SSC洗涤，37℃15min。再用0.2×SSC洗15min，室温。离心甩干玻片液体，扫描记录。用含有1100余个已知基因的中密度芯片，对每组标记的cDNA杂交。杂交后芯片用ScanArray 4000扫描仪扫描获取微阵列图像，扫描图像经ScanAlyze2.51软件分析。反复试验3次。

1.3.5 基因表达差异的评价标准 在应用ScanAlyze软件进行芯片数据分析处理中，基因表达改变的临界点设定为0.5与2.0，当两组组织中基因表达的强度比值（cy5／cy3）大于2.0或小于0.5时，即认为它们存在差异表达。图像中芯片杂交的荧光信号cy3显示为绿色，cy5为红色，如果某一点cy5信号强于cy3，则两种荧光信号叠加后呈红色（表达上调），反之呈绿色（表达下降）；表达无明显差异则呈现黄色。本实验中每一对组织的基因差异表达比较共进行3次，只有当一个基因在3次重复实验中均出现相同趋势变化（大于2.0或小于0.5），或3次实验中有2次出现相同趋势改变且第3次结果不矛盾时，方判定为差异表达基因。

1.3.6 Northern杂交 为了对两组芯片杂交的可靠性进行证实，随机选取DNA芯片中表达上调、下调或表达变化无显著差异的基因，进行Northern杂交。Trizol溶液提取的组织总RNA各约20μg，经甲醛变性凝胶电泳后，毛细管法转移至尼龙膜，80℃烘烤固定2h。将质粒扩增所得DNA探针用32P－dCTP进行随机引物标记，按QIAquick探针纯化试剂盒方法进行纯化，充分洗膜后，用感光胶片进行自显影，检测mRNA的相对含量。所有样膜用Actin cDNA探针再杂交，用作内参照。最后进行吸光度扫描，分析杂交信号。

2 结 果

2.1 P57kip2基因在不同组间的差异 实验结果提示正常对照组中P57kip2在神经管形成前后表达显著上调（cy5／cy3＞2.0），而在RA诱导组中，P57kip2基因在E9.5d，E10.5d两个时相点呈现一致变化，P57kip2在RA作用后呈现下调趋势（RA诱导组 E9.5dcy5／cy3＜0.5；RA诱导组E10.5dcy5／cy3＜0.5），见表1。

表1 P57kip2基因在不同组间的表达（n＝30）

2.2 CDK5基因在不同组间的差异 实验结果提示正常对照组中CDK5在神经管形成前后表达显著上调（cy5／cy3＞2.0），而在RA诱导组，CDK5基因在E9.5d，E10.5d两个时相点呈现一致变化，CDK5在RA作用后呈现下调趋势（RA诱导组E9.5dcy5／cy3＜0.5；RA诱导组E10.5dcy5／cy3＜0.5），见表2。

表2 CDK5基因在不同组间的表达（n＝30）

2.3 Northern杂交验证结果 为了证实芯片杂交结果的可靠性，分别对P57kip2、CDK5基因进行Northern杂交验证。验证结果提示与芯片杂交结果相同。

3 讨 论

神经胚形成是中枢神经系统早期发育中最主要的形态学事件。神经板准确、及时的闭合形成神经管是其正常发生的关键。否则会导致畸形的产生，如NTD、脊柱裂、无脑畸形等。神经管的形成是该过程结束的标志。体内外任何异常因素的作用均可导致神经管缺陷的发生。众所周知，细胞周期调控和细胞凋亡准确、有序的进行是保证神经管正常发生的关键因素。正常神经管关闭期间，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）作为重要的细胞周期抑制因子，通过抑制细胞从G1期到S期的转化进入DNA合成，从而确保蛋白质复合物的准确组装，从而调节正常有序的细胞分化［2－3］。

本课题组在前期的实验发现正常神经管形成前后及RA诱导产生NTD后P57kip2基因表达有明显差异，P57kip2在神经管形成前后表达显著上调，而在RA诱导致NTD中，P57kip2表达在E9.5d、E10.5d两个时相点呈现一致变化，呈现下调趋势［4］。表明在神经管关闭期间，RA作用后，P57kip2的表达水平降低，从而促进细胞从G1期到S期的转化，干扰了神经祖细胞的定向分化，致使细胞周期相关因子的监管功能失控，导致正常细胞不能有序分化，形成发育缺陷的神经管。提示P57kip2是一种重要的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，参与了细胞周期调控、促进凋亡、诱导分化［5］。可能通过调控转录和翻译过程，调节细胞周期，控制细胞基因和蛋白质的结构［6］。但在神经胚形成时期，在RA的干扰下P57kip2的作用途径是否发生了改变，尚需进一步探讨。

通过进一步实验课题组发现正常神经管形成前后及RA诱导产生NTD后CDK5基因表达差异明显，CDK5在神经管形成前后表达显著上调，而在RA诱导致NTD中，CDK5表达在E9.5d、E10.5d两个时相点呈现一致变化，呈现下调趋势。CDK5在细胞分裂中的作用尚不明确。CDK5是CDK的家庭成员，是一种多功能蛋白质，在神经系统的发育和分化过程中发挥独特的作用。研究表明，CDK5／P35能调节磷酸化的微管相关蛋白，促进神经细胞的迁移、轴突生长与导向，并在神经细胞的发育过程中起支持细胞骨架动力的作用［7］，在神经系统发育成熟过程中扮演了重要角色，其表达随着细胞逃逸出细胞周期而逐渐升高［8－9］。Trunova等［10］通过敲除小鼠的 CDK5基因获得NTD模型，甚至出现胚胎期致使的严重缺陷，提示CDK5是CNS发育必要的关键基因之一。实验结果提示RA作用后CDK5表达下调，推测可能通过减少CDK5数量，降低CKIs抑制因子与CDK5的结合力，导致细胞从G1期到S期的转化过程抑制减弱，使DNA蛋白的正确组装受到干扰，从而干扰细胞的正常有序的分化，促进了神经管的发育缺陷。目前RA和CDK5之间具体作用机制的细节尚不明确，须进一步探索研究。

实验结果显示P57kip2、CDK5基因参与了NTD的发生过程，但对其具体作用机制尚不明确，虽然国内部分学者对其进行了较深入的研究［11－12］，但其作用机制的细节问题还不清楚，需进一步研究。

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