GSK－3β、PTEN、PLK1在儿童急性髓系白血病中的表达及意义

王 妍，徐酉华，胡艳妮，孙艳辉，金 鑫，杨桂存

（重庆医科大学附属儿童医院／儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室／儿科学重庆市重点实验室／重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地 400014）

急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤，传统的化疗和干细胞移植使儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的5年生存率达到80%，而急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患儿的5年生存率只接近60%［1］。新型分子靶向化疗药物具有更强的抗肿瘤活性，且对正常细胞不良反应小。因此，寻找儿童AML的有效分子作用靶点至关重要。

糖原合酶激酶－3β（GSK－3β）是一种多功能的胞浆丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，研究证实它是治疗2型糖尿病［2］、阿尔茨海默病［3］的有效药物靶点，并且与癌症的发生、发展密切相关［4］，但其在白血病中起激活作用还是抑制作用尚不明确。PTEN是第1个呈双专一性磷酸酶活性的抑癌基因，它作为GSK3β的上游基因，可调控GSK3β的表达［5］。在成人急性白血病中存在与张力蛋白同源的位于第10号染色体磷酸酶基因（PTEN）基因的表达缺失［6］，但儿童 ALL患者骨髓标本中PTEN蛋白的表达高于非恶性疾病儿童［7］。Polo样激酶1（PLK1）是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，可促进有丝分裂的进程，其抑制剂BI2536已经进入AML的Ⅰ期临床实验阶段［8］。有研究认为GSK－3β可能是PLK1的负调控因子，在维系PLK1的功能方面发挥作用［9］。本课题组研究GSK－3β、PTEN、PLK1在儿童AML的表达和临床的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 实验组为2012年3～9月重庆医科大学附属儿童医院血液科收治的33例初诊AML患儿骨髓（M12例，M215例，M36例，M41例，M56例，M62例，M71例 ；中位年龄6岁2个月）。按形态学、免疫学、染色体、基因（MICM）分型标准诊断。根据患儿的临床以及实验室指标按危险度分型将实验组分为高危组、中危组、低危组，每组11例。对照组为10例骨科手术切除骨中抽吸的正常骨髓。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 无菌操作取骨髓液2～3mL，肝素抗凝，聚蔗糖（FicoLL）液（相对密度1.077g／mL）分离骨髓单个核细胞（BMMNC），取约5×106个细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，混匀后－80℃保存。

表1 GSK－3β、PTEN、PLK1、β－actin的引物及目的片段大小

1.2.2 裂解骨髓单个核细胞 离心沉淀细胞，加1mL裂解液RL充分裂解细胞。分别收集水相中的总RNA及有机相中的总蛋白。

1.2.3 RT－PCR检验 按北京百泰克生物技术有限公司高纯总RNA快速提取试剂盒说明书提取RNA。按大连宝生物技术有限公司逆转录试剂盒PrimeScript®RT reagent Kit Perfect Real Time说明书进行反转录。GSK－3β、PTEN、PLK1、βactin的引物及目的片段大小见表1，PCR条件：95℃预变性5 min；然后95℃变性30s；GSK－3β、PLK1、β－actin均为55℃退火30s，PTEN 60℃ 退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR产物分析 取PCR产物8μL在25～30g／L琼脂糖凝胶中电泳，100V电泳45min。用紫外投射仪观察并用粘胶成像仪照相，照片经Metamorphose Imaging Sight软件进行分析并读取吸光度值，分别取GSK－3β、PTEN、PLK1与actin吸光度比值（GSK－3β／actin、PTEN／actin、PLK1／actin）进行半定量分析。

1.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA） 采用ELISA双抗体夹心法对有机相中的 GSK－3β、P－GSK－3β水平进行定量分析。操作步骤严格按上海沪尚生物有限公司 GSK－3β及P－GSK－3β ELISA试剂盒使用说明书进行。选择450nm波长，在酶标仪上测定A值，以标准品A值绘制标准曲线。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，两组间的比较采用t检验；组间两两比较采用F检验；两组间的相关性研究采用Pearson相关检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA 在两组BMMNC的表达 实验组GSK－3βmRNA和PLK1mRNA的平均表达量较对照组的平均表达量高（P＜0.05）；实验组PTEN mRNA的平均表达量较对照组的平均表达量低（P＜0.05）。见表2、图1。

表2 两组GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR检测结果（）

表2 两组GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR检测结果（）

组别 n GSK－3β 330.55±0.16 0.50±0.16 0.71±0.18对照组 100.41±0.09 0.63±0.25 0.57±0.18 P mRNA PTEN mRNA PLK1mRNA实验组0.012 0.012 0.040

2.2 GSK－3β蛋白及P－GSK－3β蛋白在两组BMMNC的表达情况 实验组GSK－3β蛋白的平均浓度较对照组的平均浓度高（P＜0.05）；实验组P－GSK－3β蛋白的平均浓度较对照组的平均浓度低（P＜0.01）。见表3。

图1 两组 GSK－3β、PTEN、PLK1的PCR检测结果

表3 两组 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA检测结果（pg／mL，）

表3 两组 GSK－3β、P－GSK－3β的ELISA检测结果（pg／mL，）

组别 n GSK－3β P－GSK－3β 33 2553.40±358.59 294.17±40.53对照组 10 2204.02±283.52 350.53±53.32 P实验组0.014 0.002

2.3 GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白及P－GSK－3β与临床指标的相关性 实验组GSK－3βmRNA、PTEN mRNA、PLK1mRNA、GSK－3β蛋白 及 P－GSK－3β的表达与性别、肝脾是否肿大均无明显相关性，仅GSK－3β蛋白的表达与外周血白细胞计数增高呈正相关（P＝0.011）。临床危险度高则 GSK－3βmRNA［高危组高于中危组（P＝0.012），高危组高于低危组（P＝0.000）］、GSK－3β蛋白［高危组高于中危组（P＝0.012），高危组高于低危组（P＝0.003）］、PLK1mRNA［高危组高于低危组（P＝0.009）］表达相应增高。临床危险度高则P－GSK－3β表达减低［高危组低于中危组（P＝0.047），高危组低于中危组（P＝0.036）］。PTEN mRNA的表达与临床危险度分型无明显相关性。

2.4 GSK－3β与PTEN mRNA、PLK1mRNA表达的相关性本研究中 GSK－3βmRNA、P－GSK3β与 PTEN mRNA 的表达无明显相关性（r＝－0.265，P＝0.136；r＝0.023，P＝0.899），GSK－3β蛋白与PTEN mRNA的表达呈负相关（r＝－0.415，P＝0.016）。GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白与PLK1mRNA 的表达呈正相关（r＝0.388，P＝0.026；r＝0.427，P＝0.013），P－GSK3β与PLK1mRNA的表达无明显相关性（r＝－0.319，P＝0.070）。

3 讨 论

分子靶向药物在白血病治疗中发挥越来越重要的作用。近来研究表明GSK－3β为癌基因，使用GSK－3β的抑制剂BIO后TF－1、U937、K562和HL60细胞大量凋亡，但不影响正常造血干细胞的活性［10］。另有研究表明GSK－3β为抑癌基因，在APL中，ATO激活GSK－3β诱导 Mcl－1降解进而诱导NB4细胞分化［11］。本课题组前期研究表明儿童ALL中GSK－3β起癌基因的作用［12］。本实验结果显示儿童AML中GSK－3β在基因及蛋白水平均高表达，且表达水平与临床分型呈正相关，GSK－3β蛋白与外周血白细胞计数呈正相关；P－GSK－3β低表达，与临床分型呈负相关。因此，GSK－3β在儿童AML中可能同样起癌基因的作用。

本研究中儿童AML骨髓标本中PTEN mRNA的表达量明显低于对照组，其在儿童AML中可能起抑癌作用，但其表达量与临床指标无相关性。

PLK1目前被认为是肿瘤治疗过程中有价值的作用靶点，在AML动物模型中，PLK1的特异性的抑制剂NMS－P937联合阿糖胞苷口服后，可使其较好地长期存活［13］；在成人AML中PLK1高表达，与不良预后呈明显正相关［14］。本研究中儿童AML骨髓标本中PLK1mRNA的表达量同样明显高于对照组，且其表达量与临床分型呈一定正相关，表明PLK1在儿童AML中可能同样起癌基因的作用。

肿瘤中抑癌基因PTEN主要通过两种作用途径调控GSK－3β的表达：一种为通过降低对PI3K／AKT信号通路的抑制，增强AKT对GSK－3β的抑制性磷酸化，GSK－3β的表达减少［5］；一种为通过增强对cdc42活性的抑制，降低cdc42信号通过对GSK－3β的抑制作用，GSK－3β的表达增加［15］。本研究初步显示儿童AML中，GSK－3β蛋白与PTEN mRNA的表达呈现一定负相关。因此，儿童AML中，PTEN可能主要通过cdc42信号通路调控GSK－3β的转录后水平的表达。

在肺癌中，GSK－3β的抑制剂LiCl能增强PLK1的启动子活性，促进PLK1的表达，提示GSK－3β可能是PLK1的负调控因子［9］。而本研究结果显示 GSK－3βmRNA、GSK－3β蛋白与PLK1mRNA的表达呈正相关。本课题组前期研究表明儿童ALL中 GSK－3β高表达，且其正向调控 NF－κB信号通路［12］。Lin等［16］研究表明 NF－κB的亚基 RelA 通过直接与PLK1的启动子结合，增强PLK1的转录。因此，在儿童AML中，GSK－3β可能通过正向调控 NF－κB信号通路从而增强PLK1的转录。

综上所述，儿童AML中，GSK－3β和PLK1可能起癌基因的作用，而PTEN起抑癌基因的作用，三者在白血病中的作用机制有待进一步探讨，可能成为儿童AML危险度分型的指标及靶向治疗的有效作用靶点。

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