牦牛乳酪蛋白胶束琥珀酰化修饰研究

杨 敏，梁 琪，杨继涛，张 媛

(1.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州730070;2.甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃兰州 730070;3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070)

牦牛是青藏高原特有的优势畜种，长期生活在海拔3000m 以上无污染的高寒草原，牦牛乳是不折不扣的天然绿色食品，也是青藏高原地区牧民最主要的生活物资来源。近年来，世界牦牛乳年产量已增加至4000 万t，使得这一独特资源越来越受到众多学者的关注［1-4］。牛乳经脱脂、酸沉淀、脱水、干燥后制成粉末状制品即为酪蛋白，又称干酪素。酪蛋白及其制品有着较高的营养价值和良好的功能特性，适合作为乳化剂、增稠剂和营养强化剂等，广泛应用于食品工业、化学工业和医药工业［1，5］。甘肃省是全国最大的酪蛋白生产基地，有酪蛋白生产企业12 家，均以牦牛乳为原料，年产牦牛乳酪蛋白1.35 万t 以上，占全国酪蛋白总产量的90%以上。蛋白质的酰胺化作用具有显著改变蛋白质的净电荷，从而改善其乳化性、溶解性、凝胶性等功能特性的作用［6-7］。琥珀酸酐具有低毒、安全性高等优点，是蛋白质改性用的主要酰化试剂，其反应原理如图1 所示。琥珀酰化修饰不仅可以增加酪蛋白胶束的净负电荷，还能显著提高其乳化性能［8］。

图1 蛋白质琥珀酰化反应原理Fig.1 Succinylation reaction principle of protein

为了提高牦牛乳酪蛋白的功能特性，扩大其应用范围，本研究以琥珀酸酐为酰化试剂，以牦牛乳酪蛋白为原料，采用响应曲面法优化了酰化工艺，获得了最佳酰化条件，并测定了修饰酪蛋白的乳化特性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳酪蛋白 由甘肃华羚生物科技有限公司提供，其中酪蛋白含量为94.20%，水分含量为3.12%;乙醇、丁二酸酐、琥珀酸酐 天津市凯信化学工业有限公司;氢氧化钠 天津市化学试剂三厂;盐酸 天津市化学试剂三厂;十二烷基磺酸钠 天津市福晨化学试剂厂。

UV-2100 双光束紫外-可见分光光度计 北京北分瑞利分析仪器(集团)有限责任公司;精密电子天平 上海良平仪器仪表有限公司;DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器 金坛市顺化仪器有限公司;PHS-3C-01 实验室pH 计 上海三信仪表厂;立式高速冷冻离心机(KR25i) 法国Jouan 公司;XHF-D 型内切式匀浆机 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛乳酪蛋白溶解 准确称取1.0000g 牦牛乳酪蛋白，加入100mL 去离子水中，在40℃磁力搅拌下并用1.0mol·L-1NaOH 溶液不断调节pH 使其稳定在7.0 直至酪蛋白完全溶解，备用。

1.2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀酰化工艺优化

1.2.2.1 酪蛋白与琥珀酸酐配比的选择 设定琥珀酸酐:酪蛋白(g/g)分别为0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1，采用2.0mol/L 和1.0mol·L-1的NaOH 溶液调节酪蛋白溶液pH 至8.0，反应温度为50℃，反应时间为50min，在磁力搅拌下分多次加入琥珀酸酐，并保持溶液pH 稳定在8.0，反应结束后将溶液定容至250mL，考察酪蛋白的酰化程度，每个水平重复三次，下同。

1.2.2.2 酰化pH 的选择 将反应pH 分别设定为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，采用优化后的最佳配比，其他反应条件同1.2.2.1，考察酪蛋白的酰化程度。

1.2.2.3 酰化温度的选择 设定反应温度为30、40、50、60、70、80℃，采用优化后的最佳配比和pH，反应时间为50min，考察酪蛋白的酰化程度。

1.2.2.4 酰化时间的选择 设定反应时间分别为30、40、50、60、70、80min，采用优化后的最佳配比、pH 和反应温度，考察酪蛋白的酰化程度。

1.2.3 酰化程度的测定 酪蛋白酰化程度采用茚三酮比色法测定，参照贾俊强等的方法并进行修改［9-10］。

茚三酮比色法:移取酪蛋白溶液1.00mL，加入2%(w/v)茚三酮溶液1.00mL，混合液于沸水浴中加热5min，迅速冷至室温，加入5.00mL 蒸馏水，在580nm 波长下测定溶液的吸光度，蒸馏水做参比液。

式中:Y 为酰化程度，%;a 为未酰化蛋白溶液的吸光度;b 为酰化蛋白溶液的吸光度。

1.2.4 酰化酪蛋白的制备 用1.0mol·L-1HCl 溶液将酰化后酪蛋白溶液pH 调至等电点，于3500 ×g 离心15min，弃去上清液，将沉淀置于钢制托盘进行冷冻干燥，温度为-50℃，压强为500 ～600Pa，时间为24h，得到白色粉末状酰化酪蛋白制品，备用。

1.2.5 乳化性的测定 取6.00mL 浓度为2mg/mL 的酰化酪蛋白溶液(溶解方法同1.2.1)与2.00mL 一级精炼大豆油混合于试管中，于20000r/min 均质1min，分别在0min 和静置10min 时从距离试管底部0.5cm 处取50μL 乳液并与5mL 质量浓度为1g/L 的SDS 溶液混匀，以浓度为1g/L SDS 溶液做参比，于500nm 处测定吸光度［11］。

乳化活性指数(EAI)及乳化稳定性指数ESI 的计算公式如下:

式中，C 为乳化前酪蛋白溶液的浓度，g/mL;D 为稀释倍数，100;Φ 为乳液中油相的体积分数，0.25;A0为乳液静置0min 的吸光度;A10为乳液静置10min 的吸光度。

1.2.6 响应面设计 考虑到琥珀酸酐用量增大致使酰化程度增加主要在于反应物浓度增加使反应程度增大，与反应条件交互作用不大，因此固定琥珀酸酐与酪蛋白的配比，采用Box-Behnken 设计方法，设计三因素三水平共17 次独立实验，其中析因部分实验次数为12 次，中心点重复实验为5 次，用以估算实验误差。响应曲面因子及水平见表1。

表1 响应面因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM

1.2.7 统计学方法 各组数据均为3 次实验的平均值，以平均值±标准差表示;数据采用SPSS 18.0 进行统计分析;利用Design Expert 8.0.6 进行响应曲面实验设计及分析，采用Origin 8.0 作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酪蛋白与琥珀酸酐配比的选择 琥珀酸酐与酪蛋白的配比对酰化程度的影响如图2 所示。

图2 琥珀酸酐与酪蛋白配比对酰化程度的影响Fig.2 Effect of succinic anhydride-casein ratio on the modified degree

由图2 可以看出，酰化程度随琥珀酸酐用量的增加而增大。当琥珀酸酐与酪蛋白质量比为0.6 ∶1时，酰化程度为84.75%，当配比为0.8∶1 时，酰化程度为85.45%，较配比为0.6∶1 时虽然有所增加，但是增大幅度较小，仅增加了0.82%，且差异不显著(p ＞0.05)。由此可见，随着琥珀酸酐用量的增加，酰化程度增大，这是因为反应物浓度增大致使化学反应程度增加。但是当配比达到0.6∶1 后，酰化程度增加幅度极小，此时游离氨基已经基本反应完全，剩余的少量氨基可能被紧密包埋于酪蛋白胶束内部，由于位阻效应无法完成酰化反应，因此，继续增大琥珀酸酐用量，酰化程度增大幅度较小。综合考虑酰化程度及原料成本，琥珀酸酐与酪蛋白质量比为0.6∶1 为最佳配比。

2.1.2 酰化pH 的选择 反应pH 对酰化程度的影响如图3 所示。

图3 反应pH 对酰化程度的影响Fig.3 Effect of pH on the modified degree

由图3 可以看出，反应体系pH 在碱性条件下酪蛋白酰化程度较高，pH 为8.0 ～10.0 时酰化程度较高，这是弱碱性条件利于酰胺化反应。随着pH 的增大，酪蛋白单体带上负电荷，单体间静电斥力增大，胶束的解离作用增强，单体解离程度增大［12-15］，游离氨基裸露程度增加，利于酰胺化反应。但是，碱性过强时，琥珀酸酐水解后被大量碱中和，使体系中琥珀酸酐浓度迅速降低，酰化程度显著降低。本实验选择9.0 为最佳反应pH。

2.1.3 酰化温度的选择 反应温度对酰化程度的影响如图4 所示。

由图4 可以看出，反应温度为40～50℃时酰化程度最高。温度过低，琥珀酸酐水解速率较慢，酰化反应速率也较慢，酰化程度较低。当温度过高时，琥珀酸酐水解迅速，水解产生的酸易促使酪蛋白沉淀，不利于酰化反应;另一方面，酪蛋白胶束在高温加热时易于聚集［16-17］，从而使酰化程度降低。考虑到能耗成本，选择40℃为最佳反应温度。

2.1.4 酰化时间的选择 反应时间对酰化程度的影响如图5 所示。

图4 反应温度对酰化程度的影响Fig.4 Effect of temperature on the acylation degree

图5 反应时间对酰化程度的影响Fig.5 Effect of reaction time on the acylation degree

由图5 可以看出，当反应时间为50min 时，酪蛋白酰化程度最高。随着时间的延长，酪蛋白胶束在长时间热处理下发生聚集［16-17］，致使部分氨基被包埋于胶束内部，由于位阻效应无法酰胺化，酪蛋白酰化程度降低。由此可见，酰化反应时间为50min 即可。

2.2 牦牛乳酪蛋白琥珀酰化条件的响应面法优化

2.2.1 响应面设计及结果 响应曲面设计及实验结果见表2。

表2 响应面设计及结果Table 2 Design and results of RSM

表3 回归与方差分析结果Table 3 Result of regression and variance analysis

2.2.2 拟合模型的建立及显著性分析 利用Design Expert 8.0.6 软件对表2 中的实验数据进行多元回归拟合，得到牦牛乳酪蛋白琥珀酰化程度对反应温度、反应时间、pH 的实际值全变量二次多项回归模型方程为:

在三种因素中，温度对酰化程度影响最大，时间的影响最小。

2.2.3 响应面交互作用分析及优化结果 根据回归分析结果得出当琥珀酸酐与酪蛋白配比固定为0.6∶1 时，A、B、C 及各因素之间的交互作用对酪蛋白酰化程度的影响如图6 所示。

从图6a 可以看出，固定pH 为9.0，随着温度的升高，酰化程度先增加，后减小，温度对酰化程度的影响较明显。随着反应时间的延长，酰化程度增大幅度趋于平缓甚至有所降低，可见部分酪蛋白在热处理下随着处理时间的延长聚集程度增大，游离氨基包埋量增加，酰化程度有所降低。当温度约为42℃、时间约为50min 时，酰化程度达到最大。等高线呈现椭圆形，说明时间与温度的交互作用对酰化程度影响较大。由图6b 可以看出，反应时间固定为50min 时，pH 对酰化程度的影响呈现先增大后降低的趋势，在弱碱性环境中酰化程度较大。随着温度的升高，等高线密度增大，随着pH 的增大，等高线密度基本不变，说明温度对酰化程度的影响大于pH。由图6c 可以看出，pH 与时间交互作用的等高线基本呈现圆形，说明交互作用对酰化程度影响不显著。

图6 各因素及交互作用对酰化程度的影响Fig.6 Response surface of factors and interactions on the degree of acylation

利用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析可知，当琥珀酸酐与酪蛋白配比为0.6，反应温度为41.92℃，反应时间为49.20min，pH 为8.84 时，响应面有最优值，为86.32% ±0.97%。为检验响应曲面法所得结果的准确性和可靠性，又考虑到实际操作的便利，将最优条件修正为:反应温度为42℃，反应时间为49min，pH 为8.8，在修正后的优化反应条件下，酪蛋白的琥珀酰化程度为86.01% ±0.33%。

2.3 牦牛乳酰化酪蛋白乳化性分析

牦牛乳酪蛋白在琥珀酰化修饰前后的乳化特性见表4。

表4 牦牛乳酪蛋白及琥珀酰化酪蛋白乳化稳定性和乳化活性Table 4 EAI and ESI values of modified yak caseins and unmodified yak casein

由表4 可以看出，琥珀酰化修饰显著改善了牦牛乳酪蛋白的乳化特性(p ＜0.01)。与未酰化酪蛋白相比，酰化酪蛋白乳化稳定性增加了161.64%，乳化活性增加了98.54%。众所周知，蛋白质的乳化性与其结构密不可分，其亲水区域与水相互作用，疏水区域与油相互作用，从而体现出一定的乳化特性。琥珀酰化修饰显著增加了酪蛋白的净负电荷，使得胶束结构伸展［8］。牛乳酪蛋白具有特殊的结构，其单体肽链疏水性区域与亲水性区域完全分离，分子本身具有一定的疏水性［18-19］。在琥珀酰化修饰作用下，游离氨基形成了亲水性更强的琥珀酰胺基，使得酪蛋白肽链的亲水性区域的亲水性增强，从而减缓了乳浊液中油水两相的分离、聚集和分层的速率。因此，琥珀酰化修饰显著改善了酪蛋白的乳化性。

3 结论

对牦牛乳酪蛋白进行了琥珀酰化修饰，采用响应面法优化了酰化工艺，得出最佳反应条件为温度42℃，反应时间49min，pH8.8;在最优条件下，牦牛乳酪蛋白的琥珀酰化程度约86.01%。酪蛋白琥珀酰化反应条件温和，参数可调范围较大，易于调节和控制，酰化修饰程度高。

琥珀酰化修饰增加了酪蛋白胶束的净负电荷，使其结构伸展，亲水性增强，乳化稳定性和乳化活性显著改善，分别提高了161.64%和98.54%。因此，修饰酪蛋白可作为性能优良的乳化剂。然而，琥珀酸酐虽然毒性较低，但其并非食品添加剂，琥珀酰化修饰酪蛋白能否用于食品工业还需对其食用安全性进行评估。

［1］甘伯中，常海军.余群力，等.牦牛曲拉干酪素脱色工艺优化［J］.农业工程学报，2006，22(10) :203-207.

［2］余群力，甘伯中，敏文祥，等.牦牛“曲拉”精制干酪素工艺研究［J］.农业工程学报，2005，21(7) :140-144.

［3］Li H M，Ma Y，Dong A J，et al.Protein composition of yak milk.［J］.Dairy Science ＆ Technology，2009，90(1) :111-117.

［4］余群力，韩玲，蒋玉梅，等.白牦牛乳营养成分及风味物质分析［J］.营养学报，2005，27(4) :333-335.

［5］Braga A，Menossi M，Cunha R.The effect of the glucono-［delta］- lactone/caseinate ratio on sodium caseinate gelation［J］.International Dairy Journal，2006，16(5) :389-398.

［6］李磊，迟玉杰，王喜波，等.超声-琥珀酰化复合改性提高大豆分离蛋白乳化性的研究［J］.食品工业科技，2011，32(3) :123-127.

［7］王喜波，迟玉杰，胥伟.超声辅助琥珀酰化改性大豆蛋白研究［J］.东北农业大学学报，2011，42(5) :6-13.

［8］Vidal V，Marchesseau S，Lagaude A，et al. Influence of chemical agents on casein interactions in dairy products:chemical modification of milk proteins［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，1998，12:7-14.

［9］Paik W K，Kim S.Effect of methylation on susceptibility of protein to proteolytic enzymes［J］.Biochemistry，1972，11(14) :2589-2593.

［10］贾俊强，乐文俊，韩萌，等.乙酰化改性蚕蛹蛋白条件的优化［J］.食品科技，2011，36(3) :70-75.

［11］Jiang S J，Zhao X H.Transglutaminase-induced crosslinking and glucosamine conjugation of casein and some functional properties of the modified product［J］.International Dairy Journal，2011，21(4) :198-205.

［12］Liu Y，Guo R.pH-dependent structures and properties of casein micelles［J］.Biophysical Chemistry，2008，136:67-73.

［13］Raouche S，Marie D，Arjen B，et al.Stability of casein micelles subjected to CO2reversible acidification: Impact of carbonation temperature and chilled storage time［J］.International Dairy Journal，2008，18:221-227.

［14］Jaubert A，Durier C，Kobilinsky A，et al. Structural organization of the goat casein micelle: effect of the physicochemical environment( pH，temperature，ionic strength) on its mineral and protein composition［J］.International Dairy Journal，1999，9:369-370.

［15］Marchin S，Putaux J L，Pignon F，et al. Effects of the environmental factors on the casein micelle structure studied by cryotransmission electron microscopy and small- angle X- ray scattering/ultrasmall- angle X- ray scattering［J］.Journal of Chemical Physics，2007，126:45-51.

［16］Anema S G，Henning K.Heat-Induced，pH-Dependent Dissociation of Casein Micelles on Heating Reconstituted Skim Milk at Temperatures below 100℃［J］.Agricultural Food Chemistry，1997，45:1108-1115.

［17］Anema S G.Effect of Milk Concentration on Heat-Induced，pH - Dependent Dissociation of Casein from Micelles in Reconstituted Skim Milk at Temperatures between 20 and 120℃［J］.Agricultural Food Chemistry，1998，46:2299-2305.

［18］McMahon D J，Oommen B S.Supramolecular Structure of the Casein Micelle［J］.Journal of Dairy Science，2008，91 ( 5) :1709-1721.

［19］Euston S R，Horne D S.Simulating the self-association of caseins［J］.Food Hydrocolloids，2005，19(3) :379-386.