气体二氧化氯对黄曲霉的抑菌效果研究

杨 莎，白小龙，晋日亚，* ，陕 方，郭凯旋，牛浩刚，吴卫东

(1.中北大学化工与环境学院，山西太原030051;2.山西农科院农产品加工研究所，山西太原030031)

谷类农作物极易感染黄曲霉菌而发霉变质，尤其是玉米小麦等常食农作物。据报道全世界每年至少有2%的谷物因污染黄曲霉而报废。由于黄曲霉危害严重［1］，对其的抑菌研究也不胜枚举，国内外学者对黄曲霉的抑菌研究集中在物理方法抑菌［2-3］和生物制剂抑菌［4-6］方面，此类方法虽然能起到较好的抑菌防霉效果，但成本较高，尤其是生物制剂，很难满足工业需求。化学抑菌法尚停留在对防霉剂的研究上，传统的防霉剂效果不甚理想且大多数存在安全隐患。二氧化氯作为联合国世界卫生组织(WHO)确认的A1 级杀菌消毒剂，以其良好的扩散性、穿透性［7］和易降解、无残留［8］的特点，已经在众多领域得到了广泛应用［9-10］。本实验尝试进一步拓宽其应用领域，采用气体二氧化氯为杀菌防霉剂，对谷物表面的黄曲霉菌进行抑菌效果研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄曲霉菌(Aspergillus flavus) 购于山西大学生物工程系;黄曲霉菌载体 选择易于感染黄曲霉菌的农作物玉米、小麦和小杂粮甜荞、苦荞，由山西农科院提供，选择颗粒饱满，无虫蛀现象的样品作实验样品;马铃薯琼脂培养基(PDA) 马铃薯去皮，称取200g、切成小块，加蒸馏水煮沸30min，2 层纱布过滤，再加20g 葡萄糖和20g 琼脂定容至1000mL，于高压灭菌锅内灭菌20min。取出后制作平板，冷却后贮存备用;自制纯度为97.3%的高纯度二氧化氯气体、葡萄糖(分析纯) 天津市江天化工技术有限公司;琼脂粉(生化试剂)、氯化钠(NaCl，分析纯) 天津市大茂化学试剂厂;无水乙醇(分析纯) 天津市北辰方正试剂厂。

ESJ200-4 型电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司;BJ-2CD 型净工作台、YXQ-LS-18S1 型自动手提式灭菌器、SPX-250B-Z 型电脑生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;2DHW 型电热套 北京中兴伟业仪器有限公司;JB-3 型定时恒温磁力搅拌器 上海雷滋新泾仪器有限公司;UV-9600 型紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄曲霉菌载体的接种 称取玉米，小麦，甜荞和苦荞各80g 并清洗晾干。取黄曲霉的活化斜面若干，在无菌操作条件下，用经过灼烧的接种环将淹没在1mL 灭菌蒸馏水中的黄曲霉菌落从活化斜面的培养基上刮下来，倒进装有谷物的烧杯中，菌悬液的量以浸没谷物为准。充分搅拌，滤去菌液，晾干待用。

1.2.2 抑菌实验设计 根据黄曲霉抑菌的有关文献以及预实验总结，设计二氧化氯抑菌浓度、抑菌时间为主要实验因素，对二氧化氯浓度和抑菌时间进行单因素实验，确定水平区间。

1.2.2.1 二氧化氯抑菌浓度测试 称取染菌小麦6份，各5g，置于六个杀菌消毒柜中，分别接入二氧化氯气体发生仪，在抑菌时间40min 的前提下，研究二氧化氯浓度对抑菌率的影响。因低浓度二氧化氯既可高效杀菌又可避免残留，设置浓度梯度为0.5、4.5、8.5、12.5、16.5、20.5mg/L 为宜。

1.2.2.2 抑菌时间的测试 称取染菌小麦6 份，各5g，置于六个杀菌消毒柜中，接入二氧化氯气体发生仪，控制抑菌浓度为12.5mg/L，研究抑菌时间对抑菌率的影响。抑菌时间梯度设置为5、10、20、30、40、50、60min 为宜。

1.2.2.3 正交实验设计 在单因素实验的基础上，以抑菌率为主要考察指标，利用正交法，选择二氧化氯浓度、抑菌时间和黄曲霉的载体类别为考察因素，每个因素设置四个水平，选用L16(45)因素水平表安排正交实验，正交实验设计水平因素见表1 所示。

表1 正交实验的因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.3 菌悬液制备 将经过二氧化氯杀菌的谷物置于装有50mL 带转子的生理盐水锥形瓶中，调节磁力搅拌器转速为1000r/min，充分离心30min，使得附着于谷物表面的霉菌孢子尽量都溶于生理盐水中，制成菌体浓度为105CFU/mL 以上的均匀菌悬液。

式中，N0表示处理前菌体的数量，N1表示处理后菌体的数量。

2 结果与分析

2.1 二氧化氯对黄曲霉菌的抑菌浓度单因素实验

由图1 所示，随着二氧化氯浓度的增加，抑菌率逐渐增加，在浓度达到8.5mg/L 时，抑菌率已经达到97.37%，继续增加二氧化氯浓度，抑菌率虽还呈现增长趋势，但增幅很小。这是由于当二氧化氯浓度达到8.5mg/L 时，对负载于小麦表面的黄曲霉的抑菌效果已经趋于最大值了，小麦表面剩余的少量黄曲霉菌为抗性很强的个体，杀灭较困难，所以继续增加二氧化氯浓度对抑菌率的影响不大。由于黄曲霉载体对抑菌率可能存在很大影响，所以选择二氧化氯浓度区间范围为4.5、8.5、12.5、16.5mg/L 为宜。

图1 二氧化氯浓度对抑菌率的影响Fig.1 Effect of concentration of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

2.2 二氧化氯对黄曲霉菌的抑菌时间单因素实验

由图2 所示，随着抑菌时间的延长，抑菌率增幅明显，当抑菌时间达到30min 后，抑菌率趋于平稳，并在30min 时抑菌率为最大值，继续延长抑菌时间对抑菌率影响很小了，考虑其原因可能为在30min，气体二氧化氯已经将绝大部分的黄曲霉菌致死，存活的少量菌种生命力较强，不易致死。继续延长杀菌时间没有意义。所以选择二氧化氯抑菌时间为10、20、30、40min 为宜。

2.3 正交实验结果与分析

按照L16(45)设计正交实验表，正交实验结果见表2 所示。

为了进一步探究实验因素对实验结果影响的显著性，进行了实验结果的方差分析，见表3。

表2 L16(45)正交实验结果及极差分析表Table 2 Result of L16(45)orthogonal test and range analysis

表3 正交实验结果方差分析表Table 3 Result of orthogonal analysis of variance

图2 二氧化氯抑菌时间对抑菌率的影响Fig.2 Effect of the action time of chlorine dioxide(ClO2)gas on the antibacterial rates

根据表2 极差分析可得，二氧化氯对黄曲霉的抑菌最佳条件为:A4B4C4，即气体二氧化氯抑菌浓度为16.5mg/L，抑菌时间为40min，黄曲霉载体为苦荞，此条件下的抑菌率高达99.99%。从表3 中方差分析可以看出，霉菌载体对抑菌率具有显著性影响，抑菌时间次之，抑菌浓度的影响不显著。而当霉菌载体为苦荞时，在正交实验表中，4、10 号实验得到的结果均为99.99%，就能量消耗考虑，优于正交实验优化出的条件，其中4 号实验抑菌时间较长，10 号实验抑菌浓度较高，以经济有效、合理利用、效率最高为原则，选择4 号实验条件，即气体二氧化氯抑菌浓度为4.5mg/L，抑菌时间为40min，黄曲霉载体为苦荞作为最优工艺条件。玉米和小麦作为易感染黄曲霉的粮食作物，当抑菌时间为40min 时，抑菌率也均高于90%。

3 结论

采用平板涂布法，评价气体二氧化氯对谷物表面黄曲霉的抑菌效果，以抑菌浓度、抑菌时间和黄曲霉菌的载体为实验因素，以抑菌率为指标，设计了L16(45)正交实验，得到以下结论:气体二氧化氯对黄曲霉的抑菌效果显著，最佳抑菌工艺为:当霉菌载体为苦荞时，气体二氧化氯浓度为4.5mg/L，抑菌时间为40min，抑菌率达到99.99%。通过正交分析得，三因素的影响显著性主次顺序为载体类别、抑菌时间、抑菌浓度。

［1］Ramirez-Camejo L A，Zuluaga-Montero A，Lazaro-Escudero M，et al.Phylogeography of cosmopolitan fungus Aspergillus flavus:is everything everywhere［J］.Fungal Biology，2012( 116) : 452-463.

［2］Rodriguez-paez C L，Perez-Reyes M C.Control of natural mycobiota in maize grains by ultraviolet( UVC) irradiation［J］.Acta Agrophysica，2011，18(2) :375-388.

［3］Ribeiro J，Cavaglieri，Vital H，et al.Effect of gamma radiation on Aspergillus flavus and aspergillus ochraceus ultrastructure and mycotoxin production［J］.Radiation Physics and Chemistry，2011(80) :658-663.

［4］Gali K K，Reddy S R，Yagnika S，et al.Exploitation of aqueous plant extracts for reduction of fungal growth and detoxification of aflatoxins［J］.King Mongkut’s institute of Technology Ladkrabang Science Technology Jounal，2010，10(2) :52-62.

［5］周启升，刘训理，张楠，等.拮抗链霉菌S24 发酵培养基的优化及其对黄曲霉的抑菌作用［J］.生物工程学报，2011，27(2) :203-211.

［6］曲春阳，潘磊庆，屠康，等.复合精油对黄曲霉联合抑菌作用研究［J］.食品工业科技，2012，33(10) :128-134.

［7］Morino H，Fukuda T，Miura，et al.Inactivation of feline calicivirus，a norovirus surrogate，by chlorine dioxide as［J］.Biocontrol Science，2009，14(4) :147-153.

［8］崔超，胡双启，晋日亚，等.气体二氧化氯的光降解规律研究［J］.中国安全科学学报，2011，21(7) :52-56.

［9］ Trinetta V，Vaid R，xu qin.Inactivation of listeria monocytogenes on ready-to-eat food processing equipment by chlorine dioxide gas［J］.Food Control，2012(26) :357-362.

［10］Vaild R，Linton R H，Morgen M T.Comparison of inactivation of listeria monocytogenes within a biofilm matrix using chlorine dioxide gas，aqueous chlorine dioxide and sodium hypochlorite treatments［J］.Food Microbiology，2010(27) :979-984.

［11］GB/T4789.2-2008 食品卫生微生物学检验菌落总数测定［S］.

［12］GB4789.15-2010 食品微生物检测霉菌和酵母菌计数［S］.