低聚合度壳寡糖制备及其组分的色谱行为分析

朱玉霞，李 恒，陈列欢，许正宏，史劲松，*

(1.江南大学药学院，江苏无锡214122;2.淮海工学院海洋学院，江苏连云港222005)

壳寡糖(Chitooligosaccharides，COS)是壳聚糖主链断裂后的降解物，在增强免疫、抗肿瘤抗癌、防腐抑菌、降低胆固醇、加速体内钙和铁的吸收以及关节组织的修复等方面都具有广泛应用前景［1］。壳寡糖的功能研究和应用开发已持续进行了近20年，其生物活性与聚合度(Degree Polymerization，DP)的关系一直是研究的热点。基础研究领域越来越倾向于针对寡糖的单组分进行多方面的功能评价，并为满足特定的生物学功能，对寡糖分子进行结构修饰或组方复配，而在应用研发领域，较多地采用组分分离工艺，实现特定组分的富集并用于功能产品的制备。近年来发现，低聚合度的壳寡糖在改善骨关节炎的症状，促进关节软骨的代谢活动方面功能突出，并具有较强的抑制肿瘤细胞生长和护肝功能［2－5］。与此同时，糖工程技术的进步为寡糖组分分离与分析技术的发展奠定了良好的基础，并推动了壳寡糖构效关系的研究。继薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)之后，质谱法(MS)、凝胶电泳法以及荧光辅助毛细管电泳法等［6－7］相继被应用于寡糖分析，使寡糖组分的精细辨别成为可能。但对于分子中含有修饰基团的组分，如含有N－乙酰基的几丁寡糖、含有O－羧甲基或N－羧甲基的壳寡糖，上述方法在进行定性和定量检测时仍存在一定困难，对含有修饰基团组分的壳寡糖的分析，一般需要多种方法联合进行，在缺乏标准品的情况下，还需要借助质谱、光谱学等手段。超高效液相色谱－质谱联用技术(UPLC－MS)是目前最为先进的用于复杂体系分离分析以及化合物结构鉴定的色谱质谱整合平台［8］，具有更高的分离度、更快的分析速度和更高的灵敏度，已广泛应用于食品添加剂、污染物残留、农药残留、兽药残留等的快速检测。本研究采用酶法降解壳聚糖和乙醇分级沉淀法获得了低聚合度壳寡糖，并利用 HPLC和UPLC－MS对其组分进行分析，初步探索了寡糖组分的色谱行为，发现寡糖在柱上的分离与分子中所含的极性基团(氨基和羟基)有直接的关系，并根据极性基团和Rf值作出相关方程，旨在为壳寡糖组分的结构分析和功能研究提供先进、可靠手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖 脱乙酰度85%，国药集团化学试剂公司;壳聚糖酶 浙江金壳生物化学有限公司;壳寡糖标品 由淮海工学院制备并提供;乙腈 色谱纯;其他化学试剂皆为分析纯;实验用水为超纯水，临用前经0.45μm微孔滤膜过滤。

Agilent1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司;Alltech ELSD 3300检测器 美国Grace公司;Waters Acquity超高效液相色谱仪，SYNAPT QTOF MS(配有电喷雾电离源，ESI)质谱仪 美国沃特世(Waters)公司;UV1700紫外可见分光光度计 上海凤凰科学仪器有限公司;GL－208型高速冷冻离心机日立集团。

1.2 实验方法

1.2.1 壳寡糖的酶法制备 将3g壳聚糖加入到100mL 2% 醋酸溶液中，搅拌使其成分溶解，调溶液pH为5.8，壳聚糖酶用量为10U/g底物，45℃恒温水浴酶解6h。酶解结束后调节溶液pH至7.0，离心(8000r/min，10 min)去除沉淀，上清液浓缩至10mL体积，分别加入无水乙醇 10、30、40、90、190mL，于4℃冰箱静置8h后，离心去除沉淀，上清液真空浓缩脱除乙醇后，经冷冻干燥得到壳寡糖样品。

1.2.2 壳寡糖数均分子量的测定 利用乙酰丙酮法测定壳寡糖数均分子量［9］。

1.2.3 TLC分析条件 配制浓度为10mg/mL的壳寡糖样品，取2μL于高效硅胶板上进行点样，置于预饱和好的层析缸中，以上行法展开。展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水/氨水=5/9/1/1.5(体积比)。显色剂采用0.3% 茚三酮正丁醇溶液，105℃显色。

1.2.4 HPLC分析条件 采用Shodex NH2P－50 4E色谱柱(5μm，250mm ×4.6mm)，流动相为乙腈－3‰的氨水(pH10)，0～5min:70%乙腈，5～60min:70%乙腈－50%乙腈梯度洗脱，样品浓度1mg/mL，流速1.0mL/min，柱温 30℃，进样体积 10μL，蒸发光散射检测器。

1.2.5 UPLC/MS分析条件 采用BEH Amide色谱柱(1.7μm，2.1mm ×100mm)，流动相为乙腈－水，0～15min:80%乙腈－20%乙腈梯度洗脱，样品浓度1mg/mL，流速 0.3mL/min，柱温为45℃，进样量1μL。

质谱分析采用电喷雾离子源(ESI+)，质谱参数设定如下:离子源温度100℃，脱溶剂气温度300℃，毛细管电压3.5kV，锥脱溶剂气流量500L/h，锥孔电压:30V，锥孔气流量:50L/h，四级杆范围 m/z:100～1200，碰撞能量6V。

2 结果与分析

2.1 低聚合度壳寡糖样品的制备

为获得低分子量壳寡糖，一是要保证足够的加酶量，二是要有足够长的酶解时间。在本实验条件下，酶解6h后，水解液中的还原糖含量不再上升。水解结束后，通过pH调节至弱碱性，使尚未水解的大分子壳聚糖沉淀，然后再通过乙醇沉淀法对较大分子的壳寡糖进行沉淀。实验研究了不同浓度的乙醇对壳寡糖的沉淀情况，TLC图谱显示(图1)，乙醇浓度＜90%时，6糖以上组分在原点没有展开，而6糖以下组分含量相对较低，乙醇浓度＞90%时，沉淀效果基本无差别，从经济方面考虑，选用90%乙醇沉淀酶解后的壳寡糖。乙醇沉淀后的溶液中主要以氨基葡萄糖－壳六糖为主，采用乙酰丙酮法测定的数均分子量为680，聚合度为3.7。而乙醇浓度低于90%，对六糖以上的组分沉淀不完全。尽管乙醇沉淀法不能精确地对各个组分进行分离，但可以作为一种制备低聚合度壳寡糖的极为有效的方法。

图1 不同浓度乙醇沉淀后的TLC图谱Fig.1 TLC chromatogram of the different concentrations of ethanol precipitation

2.2 HPLC对壳寡糖组分的分析

实验采用TLC的展开条件已能够较为清晰地显示出壳寡糖的组成，通过氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖等标准品，可以定性确定组分中含有单糖到六糖成分，但用于定量研究，TLC具有一定的局限性。尽管可以通过斑点的灰度积分获得组分的相对含量，但这种方法操作繁琐，并受多种因素影响。

利用Shodex的聚乙烯醇氨基柱(NH2P－50 4E)进行壳寡糖的HPLC分析，可以获得分离度较好的谱图。该色谱柱与硅胶氨基柱相比，在同样的流动相条件下，对糖类化合物的分离性能更高，再现性更好。对本实验的低聚合度壳寡糖进行分析，采用梯度洗脱，获得6个色谱峰，根据标准品的保留时间，可以确定图谱中1～6依次为氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖、壳六糖。其中壳三糖、壳四糖具有较高的塔板数。

由于壳寡糖存在基团修饰问题，最常见的是氨基的乙酰化。如果壳聚糖的脱乙酰不完全，就可能形成带有N－乙酰基的壳寡糖，使寡糖的色谱行为受到影响，从而产生色谱峰变宽现象，这在本实验壳寡糖样品分析中也得到体现，与标准品色谱峰相比，图2中的寡糖样品峰显然变宽，表明这些色谱峰组分还含有一定量的N－乙酰化壳寡糖。氨基柱属正向分离柱，寡糖在柱上的分离主要与分子中所含的极性基团相关，而在壳寡糖分子中，除了羟基外，还含有氨基，而且氨基的极性要大于羟基。单组分壳寡糖的分离情况实际上与分子中所含的羟基数目和氨基数目直接相关。对标样组分的Rf与分子中极性基团数(x)进行相关性作图，则Rf(x)=0.8038x+2.019，R2=0.9808。当壳寡糖分子中氨基被乙酰化后，其有效极性基团数目减少，就会导致Rf值变化，尤其是同时存在两个或三个乙酰基团时，就可能与低一个聚合度的组分混淆。因此，在图2的谱图中，单一的色谱峰也极大可能还含有乙酰化的壳寡糖，甚至是聚合度不同的组分。

表1 壳寡糖标准品HPLC保留时间Table 1 The Retention time of COS standard

图2 壳寡糖组分的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogram of the COS

2.3 壳寡糖组分的UPLC－MS分析结果

采用UPLC－MS可以对色谱峰中的组分进行定性鉴定。在壳寡糖样品的液质联用图谱中(图3)，也可以获得6个显著的色谱峰。

在三乙酰基壳四糖中，极性基团数是11，而壳三糖的极性基团数也为11，这两种物质的色谱峰并没有得到良好分离。由于氨基的极性大于羟基，三乙酰基壳四糖中含有1个氨基，壳三糖中含有三个氨基，因而在出峰顺序上，三乙酰基壳四糖要略早于壳三糖。与这种情况相似的还有二乙酰基壳三糖也早于壳二糖，尽管后者极性基团数目还要少一个。

图3 壳寡糖的UPLC/MS图谱Fig.3 UPLC/MS/MS chromatogram of the COS

3 结论与讨论

采用酶法进行壳寡糖制备，由于壳聚糖酶具有一定的底物专一性，其糖基的乙酰化程度影响降解效率，并影响产物的平均聚合度。为获得较低聚合度的壳寡糖，需要选择高脱乙酰度的壳聚糖。理论上完全脱除乙酰基的壳聚糖可以获得不含乙酰基的壳寡糖，其酶解产物也是完全意义上的壳寡糖，而含有乙酰基团的壳寡糖为杂合壳寡糖，全部氨基上都含有乙酰基团的壳寡糖又称几丁寡糖。高脱乙酰度壳聚糖价格较高，实际生产上用于制备壳寡糖的壳聚糖大都含有乙酰基，因而水解获得的寡糖中含有乙酰壳寡糖，同时由于乙酰基团的存在，使壳聚糖酶的水解位点减少，导致高聚合度产物的增加，并且这些组分并不能通过增加水解时间或增加酶量予以大幅度降低。要获得低聚合度寡糖组分，还需要采用分离工艺，如本实验使用的有机溶剂沉淀分级法，此外还有层析法、膜分离法等。沉淀法是一种操作简单、重复性好、经济可行的工艺，但该法不能对DP＜6的组分进行分离，进一步的组分分离操作常采用柱层析方式，在单体的量化制备方面，目前仍缺乏有效的、系统化的解决方案。

对壳寡糖组分色谱行为的探讨也有助于寡糖组分的分离工作，高效液相色谱柱的分离原理与制备色谱柱的原理一致，同样，寡糖组分的N－乙酰化可以导致寡糖不按照聚合度的大小进行色谱分离，如本实验中三乙酰基壳四糖出峰时间要略早于壳三糖，二乙酰基壳三糖出峰时间也略早于壳二糖，因此在进行柱层析制备壳寡糖单体时，需要考虑基团乙酰化的影响，如利用高脱乙酰的壳聚糖为原料，避免形成乙酰壳寡糖;或者对壳寡糖进行乙酰化修饰，消除氨基的影响，在组分分离后再进行乙酰基团脱除。

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