标准曲线法测定茯神中多糖的含量

张 捷，黄荣花，张书华

(陕西省铜川市药品检验所，陕西 铜川 727031)

茯神为多孔菌科卧孔属植物茯苓 Poria cocos Schw.Wolf的菌核，原物种为低等植物，是寄生在松树上的真菌，药用部分为菌核中间抱有松根的白色部分。茯神性平，味甘、淡，有渗湿、健脾、宁心等功能，用于痰饮、水肿、小便不利、泄泻、心悸、眩晕。近年来的研究发现，茯神具有养心凝神的功效，用于心神失养所致的心悸怔忡、失眠多梦等神志不宁的虚证，并常与补血养心药同用，以增强疗效。茯神对健忘病患者也有一定的辅助治疗作用，另外对小便不利患者也有缓解作用[1]。本试验采用标准曲线法[2]测定茯神药材中多糖的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Evolution 500型紫外分光光度计;AY－220型电子天平。D－无水葡萄糖对照品(批号为110833－200904，中国药品生物制品检定所);茯神药材样品的产地分别为湖南、湖北大别山、陕西汉中。所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥14 h的 D－无水葡萄糖对照品0.0201 g，置20 mL容量瓶中，加纯化水溶解至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(每1 mL含D－无水葡萄糖1.005 mg)。取本品粗粉约1 g，精密称定，加80%乙醇100 mL回流2 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，弃去乙醇液;将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，在水浴锅上回流2 h，趁热滤过，用热水洗涤4次，放冷，加水定容至250 mL，即得供试品溶液。

2.2 测定方法

精密量取样品1 mL，置具塞试管中补加水至2 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，迅速精密加硫酸5 mL，依法测定吸光度，计算含量。

2.3 检测波长选择

取供试品(含量为 29.982 mg/g)，用 Evolution 500型紫外分光光度计进行紫外扫描，结果供试品在490 nm波长处有最大吸收。

2.4 方法学考察

标准曲线制备:精密量取对照品贮备液10 mL，置100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 分别置具塞试管中，补加水至 2 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密加硫酸5 mL，摇匀，待其反应10 min，置40℃的水浴锅中保温15 min，取出后迅速冷却至室温(分别含 D － 无水葡萄 为 20.1，40.2，60.3，80.4，100.5 μg)。以对照品 0 mL 试管内的溶剂为空白，照紫外可见分光光度法(附录ⅤA)，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标、质量(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=15.661 7 X －0.082 8，r=0.999 9。结果表明，D － 无水葡萄糖质量在20.1～100.5 μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验:精密量取对照品溶液，依法测定吸光度，连续测定6次。结果的 RSD为0.145%。

稳定性试验:精密称取供试品1 g，依法制备供试品溶液，每间隔2 h测定1次(n=6)。结果的 RSD为0.549%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

重复性试验:精密称取同批样品6份，按供试品溶液的制备方法操作。结果多糖平均含量为30.007 mg/g，RSD为0.514%。

加样回收试验:称取已知含量的同一批样品(含量为30.007 mg/g)约1 g，精密称定，加入一定量的对照品，按供试品溶液的制备方法制备溶液，平行试验5次，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.5 样品含量测定

取本品粗粉约1 g，精密称定，按拟订方法制备供试品溶液，并依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液茯神中多糖的浓度，计算，即得。结果见表2。

表2 茯神中多糖含量测定结果

3 讨论

多糖的检测方法一般可分为两大类:一类是直接测定多糖本身，如高效液相色谱法和酶法，但需要有多糖的标样，而且测定结果偏低;另一类是通过显色反应测定吸光度值，即比色法，如水杨酸法、斐林法、苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法等。其中，苯酚－硫酸法由于方法简单、快速，试验成本较低，且无需多糖纯品等优点被广泛采用。此法是先用标准品多糖制作标准曲线后，再通过多糖的显色反应测定吸光度，根据其在曲线上的位置推算出多糖的浓度从而推算其含量。本试验的平均回收率在101.3% ～103.6%之间，精密度试验的 RSD在5%以内，说明以 D－无水葡萄糖为对照品，用苯酚－硫酸法测定茯神中多糖的含量可行。

试验中的苯酚要用蒸馏酚，又称重蒸酚或重苯酚，其纯度高，可用作试验中定量分析试剂，本试验中就是用苯酚重蒸馏后得到的馏分。另外，试验中试剂的加入顺序要正确，先加入待测液，再加入5%苯酚液后，迅速加入浓硫酸，摇匀，待其反应10 min，置40℃的水浴锅中保温15 min，取出后迅速冷却至室温。

多糖作为一类重要的生物活性物质，具有多种药用功能，在抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、愈溃疡等治疗方面已显示出诱人前景。随着多糖药理学及临床学研究的不断深入，含多糖类药物将具有更广阔的开发前景。

[1]江苏新医学院.中药大辞典(下册)[M].上海:上海人民出版社，1977:1 597.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:附录30.