FISH技术检测乳腺癌组织中Her-2基因的表达

张秀娟

(1.泰山医学院，山东泰安 271016;2.滕州市工人医院病理科，山东滕州 277500)

人类表皮生长因子受体HER是一簇具有酪氨酸激酶活性的高同源性蛋白质，是一种原癌基因。Slamon等［1］首先发现了Her-2基因，并且20% ～30%乳腺癌患者Her-2基因过度表达［2］。实验证明Her-2扩增与乳腺癌的进展及不良预后有关，同时也是乳腺癌患者使用单克隆抗体赫赛汀治疗的唯一指标，因此在制订乳腺癌患者的治疗方案和预测预后前准确了解Her-2基因扩增及表达状态是非常重要的。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)有敏感性高、稳定性和重复性好的优点，同时可以将17号染色体的非整倍体和单纯的Her-2基因扩增区分开来［4］，因此检测结果准确性高。本研究收集筛选96例浸润性乳腺癌石蜡切片作为研究对象。以FISH技术检测Her-2基因扩增状态，并判断其与免疫组化(IHC)结果之间的差异性和相关性，为肿瘤靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取滕州市中心人民医院2011年2013年乳腺癌标本96例，患者均为女性最小年龄28岁，最大76岁，均未接受术前放、化疗，标本经10%中性福尔马林固定至少6-8小时，其中浸润性导管癌例94例，浸润性小叶癌2例。

1.2 实验试剂

FISH检测用Her-2探针购自北京金菩嘉医疗科技公司，内含GLPHER2/CSP17，CSP17为对照探针，探针缓冲液及DAPI复染剂，Her-2兔抗人单克隆抗体、免疫组织化学SP染色试剂盒，购自福建迈新生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 FISH(荧光原位杂交技术)石蜡切片脱蜡、梯度复水后，置于50℃质量分数30%酸性亚硫酸钠20～30min，破坏细胞膜蛋白，37℃蛋白酶K消化10～20min，破坏细胞核核膜并使细胞核分散，0.1mol/LHCL室温5～10min，使探针易进入杂交，2xSSC漂洗2次，丙酮 2min，自然干燥玻片，73℃变性液5min，-20℃乙醇梯度脱水，玻片于48℃预热5min，将2μl FISH 探针、7μl杂交缓冲液及 1μl水混匀，73℃水浴箱中变性5min，取出滴加至预热玻片，加盖玻片并橡胶封边，湿盒中42℃过夜。46℃体积分数50%甲酰胺/2×SSC中10min×3次，2×SSC漂洗10min，46℃2 × SSC/0.1%NP-40 5min，室温体积分数70%乙醇3min，暗处自然干燥，滴加DAPI复染剂，暗处放置15min，中性树脂封片。

判断方法如下:GLP Her-2/CSPl7(CSPl7为对照探针，标记染色体着丝粒)标记颜色;红/绿结果判读计数肿瘤细胞集中，各通道信号清晰可辨，细胞核轮廓清楚无重叠的细胞30个，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/细胞核中绿信号总数)Ratio＜1.8为阴性结果(见图1)，提示该样本无Her-2基因扩增，Ratio＞2.2为阳性结果(见图2)，提示样本中Her-2基因发生扩增，Ratio在1.8～2.2之间可以选择增加计数细胞至100个或重做FISH实验，每个细胞中绿色信号数3为17号染色体多体［5］。

1.3.2 IHC(免疫组化法)石蜡切片经脱蜡、梯度复水后，于10mmol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中，水浴修复抗原3min，消除内源性过氧化物酶的活性。正常兔血清封闭非特异性抗原15min，滴加兔抗人Her-2单克隆抗体，40℃放置过夜;滴加生物素化二抗，37℃放置30min;滴加SP，37℃放置30min。DAB显色;苏木素复染;中性树脂封片。判读方法［6］如下:Her-2的表达定位在细胞膜，无着色为0(见图3);任何比例的浸润癌细胞呈微弱不完整的细胞膜着色为(+)(见图4);＞10%浸润癌细胞呈现弱至中等强度完整但不均匀细胞膜棕黄色着色或＜30%的浸润癌细胞呈强且完整的细胞膜棕褐色着色为(++)(见图5)，＞30%的浸润癌细胞呈强且完整的细胞膜棕褐色着色为(+++)(见图6)。

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，IHC与FISH采用Kappa一致性检验分析，P＜0.05认为两种方法检验具有一致性。

图1 Her-2基因扩增

图2 Her-2基因不扩增

图3 Her-2在癌组织中无细胞膜着色

图4 Her-2在癌组织中呈微弱的、不完整的细胞膜着色

图5 Her-2在癌组织中呈中等强度的完整但不均匀的细胞膜着色

图6 Her-2在癌组织中呈较强的完整的细胞膜着色。

2 结果

FISH检测96例浸润性乳腺癌Her-2基因，Her-2基因扩增24例，阳性率25%(24/96)，在IHC(±)标本中，Her-2基因未扩增67例，阴性符合率为94.37%;在IHC(++)标本中，Her-2基因扩增10例，阳性符合率71.43%;在IHC(+++)标本中，Her-2基因扩增 10例，阳性符合率90.91%(见表1)。

表1 FISH和IHC检测Her-2表达

3 讨论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，且发病率逐年上升［7］。Her-2基因在乳腺癌组织中的过度表达，不仅是乳腺癌的一个独立的不良预后因素，还可以用来预测肿瘤对化疗药物的敏感度，如Her-2阳性者使用紫杉类化疗较蒽环类效果更佳，更重要的是还可以把Her-2作为靶向治疗［8-9］的目标进行个体化治疗，为乳腺癌的治疗开辟了一个新领域。大量临床试验证明，赫赛汀对于Her-2过度表达的乳腺癌患者有着显著的疗效，能提高患者的生存率和生活质量，因此，目前针对乳腺癌进行Her-2检测已成常规，但靶向治疗成本昂贵，并存在心脏不良反应，因而Her-2检测的准确性非常重要，应达到尽可能高的特异性和敏感性。

目前FDA批准用于Her-2检测的方法有IHC法和FISH法。IHC是临床上常用的Her-2蛋白检测方法，该方法操作简便，价格低廉，可重复性好，对材料要求不高，在临床上广泛应用，但是由于抗体差异、抗原修复方法不同、组织固定和制片以及结果的主观判读等，使不同医院之间的结果差异较大。FISH技术易于定量检测，更不容易受到组织样本和观察者主观因素的影响，具有较高的准确性、灵敏度和特异性，是美国食品药品监督管理局批准的检测Her-2基因扩增的金标准［10］。

本试验分别使用FISH及IHC对96例乳腺癌的Her-2状态进行检测，Her-2基因扩增比例为25%，这一结果与多数研究结果相一致［11］，IHC阴性至强阳，Her-2基因扩增的比例逐渐增高，这与其他研究结果相符，即Her-2蛋白免疫组化强度越高，患者Her-2基因扩增的可能性就越大，同时结果表明IHC(±)和IHC(+++)时与FISH的结果符合率较高，参照国外的检测经验，即在美国IHC(+++)为Her-2阳性，可接受治疗;澳大利亚及欧洲一些国家，将IHC和FISH同时作为Her-2检测的一线技术，我们认为有条件的患者应同时进行FISH及IHC检测，以排除假阴性及假阳性，如果没有FISH检测条件，可将IHC作为初步筛查手段，检测结果为IHC(±)或(+++)对治疗也有一定意义，但IHC(++)时Her-2基因扩增符合率较低，若经济条件允许，还是建议进行FISH的检测，以免错过了使用Herceptin治疗的机会。

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［4］ Petroni S，Addati T，Mattioli E，et al.Centromere17copy number alteration:negative prognostic factor in invasive breast cancer［J］.Arch Path o l Lab Med，2012，136(9):993-1000.

［5］ 王文义，王桂芝，张明智.荧光原位分子杂交技术检测乳腺癌组织中HER-2基因的表达［J］，医药论坛杂志，2011，32(13):60-03.

［6］ 乳腺癌HER-2检测指南(2009版)编写组.乳腺癌HER-2检测指南(2009版)［J］.中华病理学杂志，2009，38(12):836-840.

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［11］ 蔺会云，许春伟，李红霞，等.乳腺癌HER-2基因扩增与临床病理特征的关系［J］.诊断病理学杂志，2013，20(8):491-504.