阿托伐他汀对阿尔茨海默病模型小鼠学习、记忆功能及Klotho 蛋白的影响

杨松 吴德红 柯燕 蔡克涛 武谦

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)发病可能与一种名为Klotho 的衰老相关基因有关［1］。该基因主要在脑内海马组织表达，基因敲除的Klotho 小鼠过早出现和人类衰老、老化相关的多种行为和病理生理改变［2］。进一步研究发现在小鼠海马组织内，Klotho蛋白可能通过与细胞膜表面的特定受体结合而启动细胞内的信号传导，该信号传递可以抑制胰岛素胞内信号传导从而出现胰岛素抵抗［3］。

近年来，阿托伐他汀对痴呆的防治作用正逐渐引起人们的关注［4］。国外研究证实，他汀类药物不仅能预防痴呆，对罹患痴呆的病人，还可能延缓和改善痴呆的进展和症状［5-6］。

本文通过观察阿托伐他汀对痴呆模型小鼠学习、记忆功能及Klotho 蛋白的影响，初步探讨阿托伐他汀改善痴呆的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性昆明种健康小鼠40 只，体质量27 ～35 g，6 周龄，由湖北医药学院实验动物中心提供，动物合格证号110425，随机分为模型组、生理盐水组、阿托伐他汀组和加兰他敏组，每组10 只。

1.2 药物、试剂及仪器 阿托伐他汀(北京嘉林药业，110211429);加兰他敏(西安杨森制药有限公司，940929);Aβ1-40购自于美国sigma 公司;将Aβ1-40溶解在高压灭菌生理盐水内，贮存液浓度10 g/L，过滤除菌，－20 ℃保存。临用前37 ℃孵育4 d，使其变为聚集状的Aβ。Klotho 及胰岛素的ELISA 试剂盒购自上海蓝基生物有限公司，严格按照试剂说明书操作;其他相关仪器均由十堰市太和医院生命研究所提供。

1.3 模型制备 动物以10%水合氯醛250 mg/kg 腹腔注射麻醉后，以立体定位仪固定头部，剪开头皮，暴露头骨，在前囟后、中线右侧旁，用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自脑表面垂直进针，模型组、阿托伐他汀组和加兰他敏组动物于右侧脑室内缓慢注射10 mg/ml 的Aβ1-402 μl，生理盐水组动物相同部位注射同等容积生理盐水，留针5 min 后慢慢退出。以庆大霉素9 mg/kg局部消毒，缝合皮肤。

1.4 动物处理 阿托伐他汀组动物给予阿托伐他汀5 mg/kg 灌胃，加兰他敏组动物给予加兰他敏1.03 mg/kg 灌胃，生理盐水组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每天1 次，进行28 d。

1.5 Morris 水迷宫实验 根据Morris 实验方法进行操作［7］，实验分为两部分:(1)定位航行实验:用于测量小鼠对水迷宫学习和记忆的获取能力。第1 天让小鼠自由游泳2 min;从第2 天起，每天分上、下午两段，每段训练4 次。训练时随机选择一个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠寻找并爬上平台时所需时间(潜伏期)，每次训练间隔为60 s。如果大鼠在120 s 内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期记为120 s。(2)空间搜索实验:在第5 天最后一次训练后撤除水下平台，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，测其在120 s 内跨过原平台相应位置的次数。

1.6 Klotho 蛋白及胰岛素的检测 将各组小鼠置于冰盘上开颅取脑，弃去嗅球和小脑，称取海马组织，用预冷的生理盐水制成10 g/L 匀浆，4 ℃下3000 r/min离心15 min，取上清液－20 ℃保存。采用酶联免疫分析法测定海马组织Klotho 蛋白及胰岛素含量。

1.7 统计学分析 数据采用SPSS 16.0 进行统计学分析，组间比较采用t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验 与模型组小鼠相比，阿托伐他汀组、生理盐水组和阳性对照组动物的逃避潜伏期明显缩短，而跨越平台次数明显增加，差异存在统计学意义(P ＜0.05);阿托伐他汀组与生理盐水组、加兰他敏组相比，其逃避潜伏期及跨越平台次数无明显差异。见表1。

表1 各组小鼠Morris 水迷宫学习及记忆成绩比较(±s，n=10)

表1 各组小鼠Morris 水迷宫学习及记忆成绩比较(±s，n=10)

注:与模型组比较，* P ＜0.05

组别逃避潜伏期(s) 跨越平台次数(n)45.78 ±3.201.64 ±0.91生理盐水组19.86 ±2.35*7.86 ±1.34*阿托伐他汀组24.44 ±3.05*5.38 ±1.36*加兰他敏组21.39 ±2.78*5.51 ±0.85模型组*

2.2 海马组织Klotho 蛋白及胰岛素水平 生理盐水组和阿托伐他汀组动物Klotho 蛋白定量明显高于模型组(P ＜0.05);与模型组比较，阿托伐他汀组胰岛素水平明显增加(P ＜0.05);模型组与生理盐水组及加兰他敏组的胰岛素定量测定无明显差异。见表2。

表2 阿托伐他汀对Klotho 蛋白及胰岛素的影响(x¯±s，pg/ml，n=10)

3 讨论

加兰他敏是从石蒜属植物中分离出的可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂，用于治疗轻度到中度阿尔茨海默型痴呆症，可改善记忆障碍［8］。本研究以加兰他敏处理作为阳性对照，以探讨阿托伐他汀对AD 小鼠的影响。

他汀类药物可能通过调节脑内胆固醇代谢、抑制载脂蛋白E 表达、减少β 淀粉样蛋白形成、降低卒中风险和增强胆碱能神经元功能等机制起到防治痴呆的作用［9］。近年来研究显示，他汀可通过上调Klotho 基因的表达而部分纠正衰老相关的症状及体征［10-11］。本文结果提示阿托伐他汀可改善痴呆小鼠的学习及记忆功能，其机制可能与对Klotho 基因表达的上调有关。

最新研究发现，Klotho 基因不但在脑脉络膜大量表达，海马内也有很强的表达［3］;该基因过度表达的小鼠体内血浆Klotho 蛋白浓度升高的同时，胰岛素的水平也明显升高，相反Klotho 基因缺陷的同时胰岛素浓度也出现下降［1］。进一步的研究认为Klotho 蛋白通过与细胞膜表面尚未鉴定的特定受体结合而启动了细胞内的信号传导，该信号传递可以抑制胰岛素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的胞内信号传导，因此出现胰岛素抗性;对Klotho 基因突变小鼠同时进行胰岛素/IGF-1 通路干涉处理后，这种小鼠的衰老症状明显缓解［12-13］。我们的研究证实了Klotho 蛋白与胰岛素的同向性改变，提示Klotho 蛋白通过这种胰岛素信号传导途径引起的胰岛素抗性可能是改善痴呆的重要方式。

其他相关的2 种机制可能为他汀上调Klotho 基因的表达，改善小鼠学习及记忆功能作另一注解。Narumiya 等［10］发现在培养的IMCD3 细胞中，阿托伐他汀通过抑制细胞通路RhoA 途径上调Klotho 基因mRNA的表达，且这一表达有着非常显著的剂量效应关系;这一结果也被国内的研究所证实［11］。此外，氟伐他汀也被认为有促进Klotho 基因敲除杂合子小鼠血管新生的作用，其作用机制可能是通过VEGF-p-Akt-NO 路径实现的［14］。

综上所述，阿托伐他汀可改善AD 小鼠的学习及记忆功能，其机制可能与其对Klotho 基因表达的上调有关。

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