复合酶法提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究

孙勇民，岳鹍，王芃

（天津现代职业技术学院，天津 300350）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et.Zucc）为蓼科多年生草本植物，主要含有蒽醌类化合物、芪类化合物、水溶性多糖和鞣质等成分，其中芪类化合物中的功能性成分白藜芦醇因其抑制癌细胞、降低血脂、防治心血管疾病、抗氧化、延缓衰老等作用明显，被喻为继紫杉醇之后又一新的绿色抗癌药物[1]。

虎杖中白藜芦醇通常以苷元和皂苷两种形式存在，白藜芦醇甙是白藜芦醇的葡萄糖甙，白藜芦醇甙在一定的条件下可以通过酶解脱去葡萄糖基而转化为白藜芦醇。目前常用的碱提酸沉法、微波提取、超声萃取法等能有效提取白藜芦醇，却无法有效转化白藜芦醇苷，造成资源的极大浪费和生产成本的增加[2-3]。

本试验采用纤维素酶和阿魏酸酯酶组成的复合酶对虎杖中的白藜芦醇进行提取，复合酶中的阿魏酸酯酶可切断木质素和半纤维素的交联架构，有利于虎杖细胞内容物的溶出；纤维素酶则可有效地将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。两种酶的配合使用，可显著提高虎杖中白藜芦醇的提取率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇对照品，购于Sigma 公司（含量99%）；虎杖：购于天津药材市场，产地为安徽亳州。阿魏酸酯酶（1.5×104IU/g）、纤维素酶（1.5×104IU/g）：宁夏夏盛集团；无水乙醇、甲醇：国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

BS224S 型电子分析天平：德国赛多利斯股份公司；DSHZ-300 型多用途恒温水浴振荡器：江苏太仓市实验设备厂；T6 紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；RE-52CS 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DZ-2BCⅡ型真空干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇酶法提取工艺

称取粉碎至60 目的虎杖粉末样品5.0 g，按料液比1 ∶20（g/mL）加入水后，在不同酶添加量、酶解pH、酶解温度下，酶解一定时间后加入定量的甲醇，恒温加热提取一定时间，减压抽滤、离心后定容至100 mL。

1.2.2 复合酶酶法提取工艺的优化

在单因素预试验基础上，考虑浓度等因素对后续提取的影响，选取酶添加量、酶解温度、pH 和时间4 个因素，设计四因素三水平正交试验方案，其因素水平表见表1。

表1 复合酶解法提取条件正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on enzymatic extraction

1.2.3 白藜芦醇的测定方法[4]

称取白藜芦醇标准品5.0 mg，置于50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀得浓度为0.10 mg/mL 的白藜芦醇标准储备液。吸取标准储备液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00 mL 分别置于100 mL 容量瓶中，定容后在306 nm 波长下分别测定其吸光值。

以溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制白藜芦醇的标准曲线，得到其回归方程为Y=0.122 1X+0.002 3，R2=0.999 7。白藜芦醇标准溶液浓度在0.00～8.00 μg/mL 范围内线性关系良好。

图1 白藜芦醇标准工作曲线Fig.1 Standard curve of resveratrol

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 酶添加量对白藜芦醇提取率的影响

取5.0 g 虎杖粉末，分别按表2 中的比例添加复合酶，在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解温度50 ℃、pH5.0 的条件下，酶解2.5 h，白藜芦醇的提取结果见表2。

表2 酶添加量对白藜芦醇提取率的影响Table 2 The effects of enzyme concentration on the extraction rate of resveratrol

由表2 可知，纤维素酶和阿魏酸酯酶混合使用时，白藜芦醇的提取率有明显提高；纤维素酶和阿魏酸酯酶的比例不同对白藜芦醇的提取率也有显著的影响，当纤维素酶和阿魏酸酯酶添加量均为1.5 mg/g时，白藜芦醇的提取率达到最大值1.432%。综合考虑，选择编号3、4、5 三个水平进行正交试验。

2.1.2 酶解温度的确定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解pH5.0、纤维素酶和阿魏酸酯酶添加量均为1.5 mg/g、酶解时间2.5 h 的条件下，分别采用35、40、45、50、55、60 ℃进行提取，以酶解温度对提取率作图，分析不同酶解温度对白藜芦醇提取率的影响，结果见图2。

图2 酶解温度对白藜芦醇提取率的影响Fig.2 The effects of temperature on the extraction rate of resveratrol

由图2 可知，当酶解温度为50 ℃时，白藜芦醇提取率达到最高，当温度继续升高时，白藜芦醇提取率开始下降，这是由于温度高于50 ℃，酶蛋白开始变性，导致酶活性降低，影响白藜芦醇的提取。因此，酶解温度选择45、50、55 ℃3 个水平进行正交试验。

2.1.3 酶解pH 的确定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解温度50 ℃、纤维素酶和阿魏酸酯酶添加量均为1.5 mg/g、酶解时间2.5 h 的条件下，在pH 分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5时进行提取，以酶解pH 对提取率作图，分析不同酶解pH 对白藜芦醇提取率的影响，结果见图3。

图3 酶解pH 对白藜芦醇提取率的影响Fig.3 The effects of pH on the extraction rate of resveratrol

由图3 可知，酶解pH 在3.0 到5.0 时，随着pH 增大，白藜芦醇的提取率呈现上升趋势；当pH 等于5.0时，白藜芦醇的提取率达到最大值1.459%；当pH＞5.0后，白藜芦醇的提取率呈现下降趋势。考虑到纤维素酶最适pH 范围在4.0～5.5，阿魏酸酯酶最适pH 范围在4.0～6.5，酶解pH 选择4.5、5.0、5.5 三个水平进行正交试验。

2.1.4 酶解时间的确定

在料液比1 ∶20（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解pH 5.0、纤维素酶和阿魏酸酯酶添加量均为1.5 mg/g 的条件下，分别采用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 的酶解时间进行提取，以酶解时间对白藜芦醇的提取率作图，分析不同酶解时间对白藜芦醇提取率的影响，结果见图4。

图4 酶解时间对白藜芦醇提取率的影响Fig.4 The effects of time on the extraction rate of resveratrol

由图4 可知，反应开始时，底物浓度大，复合酶可快速水解底物，白藜芦醇提取率随酶解时间的增加而快速提高，2.5 h 后白藜芦醇提取率基本稳定。考虑到能耗，酶解时间选择2.0、2.5、3.0 h 3 个水平进行正交试验。

2.2 酶解法提取白藜芦醇最佳工艺条件的确定

在单因素试验的基础上，设计复合酶法提取白藜芦醇L9（34）正交试验方案，试验结果见表3。方差分析见表4。

由表3 可知，酶解工艺中影响白藜芦醇提取率的主次因素为：酶添加量（A）＞酶解温度（B）＞酶解时间（D）＞pH（C）。提取的最佳条件组合为A2B2C2D3，即固液比1 ∶20（g/mL）、复合酶添加量3 mg/g（1.5 mg/g 纤维素酶+1.5 mg/g 阿魏酸酯酶）、酶解温度50 ℃、pH 5.0、酶解时间3.0 h。表4 结果表明，复合酶的组成对提取效果影响较大，其他各影响因素的影响程度差异不显著。

表3 酶解法提取白藜芦醇正交实验L9（34）结果与分析Table 3 Result and analysis of orthogonal L9（34）test of the enzymatic extraction

表4 试验结果方差分析表Table 4 Results of variance analysis

取正交试验最优条件组合A2B2C2D3进行3 次验证实验，白藜芦醇的提取率为（1.513±0.06）%。

2.3 复合酶提取法与其他提取方法的对比分析

选取目前常见的虎杖中白藜芦醇的提取工艺与复合酶法提取工艺进行对比[5-6]，其提取条件及提取结果见表5。

表5 白藜芦醇提取工艺的比较Table 5 Comparison of extraction technologies of resveratrol

由表5 可见，酶法提取效果明显优于传统的直接醇提法，这主要是由于虎杖细胞壁的主要成分是纤维素、木质素和果胶，纤维素酶能有效分解纤维素，将细胞壁降解为小分子或易溶物质，促进细胞壁内有效成分的释放。但对于根、茎、皮类药材，植物细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸类物质，以酯键方式与半纤维素支链形成致密网状交联结构，从空间上限制了纤维素酶对纤维素和半纤维素的有效降解。阿魏酸酯酶可有效切断木质素和半纤维素的交联架构，有利于纤维素酶与底物的接触，因此复合酶法比单一使用纤维素酶的效果有明显提高。

3 结论

本试验通过单因素试验和正交试验，得到虎杖中白黎芦醇复合酶法提取工艺的最佳条件为：固液比1 ∶20（g/mL）、复合酶添加量3 mg/g（1.5 mg/g 纤维素酶+1.5 mg/g 阿魏酸酯酶）、酶解温度50 ℃、pH 5.0、酶解时间3.0 h。在此条件下，虎杖中白藜芦醇的提取率为1.513%。复合酶解法的提取效果明显优于其他方法。

[1]潘明新,王晓阳.虎杖的化学成分及其药理作用[J].中药材,2000,23(1)：56-58

[2]任红涛,崔慧霞,赵秋艳.白藜芦醇提取工艺的优化与除杂方法的选择[J].食品工业科技,2005,26(7)：99-101

[3]黄志芳,易进海,刘倩伶,等.酶解法提取纯化虎杖提取物中白藜芦醇的工艺研究[J].天然产物研究与开发,2009,21(5)：1061-1064

[4]李婷.葡萄皮渣中白藜芦醇提取工艺研究及葡萄材料中白藜芦醇含量的差异性分析[D].兰州：甘肃农业大学,2008：26-27

[5]刘树兴,王轶钦.响应面法优化虎杖中白藜芦醇提取工艺的研究[J].陕西科技大学学报,2010,28(1)：70-74

[6]王慧竹,于江涛,张闯.正交实验法优选虎杖茎中白藜芦醇的提取工艺[J].吉林化工学院学报,2013,30(3)：25-28