迷迭香总黄酮的提取工艺

陈宝，张立颖，沈芳，*，樊红日，刘雄民，冯龙

（1.广西大学化学化工学院，广西南宁 530004；2.广西工业职业技术学院食品与生物工程系，广西南宁 530001）

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）属唇形科迷迭香属植物[1]，原产地中海沿岸一带，目前我国很多地区都有种植。迷迭香中含有萜类、黄酮、有机酸、多支链烷烃及氨基酸等多种化学成分。其中，黄酮类成分的研究较早，迄今为止已从迷迭香中分离出30 余种黄酮类化合物，主要包括橙皮素、芹菜素、蓟黄素、白杨素、高车前苷、6-羟基木犀草素-7-葡萄糖苷等，具有抗菌、消炎、降压、抗氧化、抗癌等作用[2-3]。迷迭香总黄酮的研究仅见吴建章等[4]对迷迭香黄酮的甲醇索氏提取，且黄酮提取率较低。本试验以广西巴马迷迭香为原料，采用乙醇热浸提法[5-6]提取黄酮类化合物，并优化提取工艺，旨在提高总黄酮的提取率，为该资源的开发利用提供科学的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

广西巴马迷迭香；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；无水乙醇、石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯（AR）。

1.2 仪器

UV-2550 型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；DF-101B 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市英峪予华仪器厂；FZ102 型微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；AR224CN 电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 迷迭香总黄酮的提取

提取工艺流程：干燥的迷迭香→粉碎过60 目筛→石油醚回流脱脂、脱色→风干→精确称取定量脱脂干粉→乙醇回流浸提→冷却、抽滤→总黄酮提取液→定容至料液比相应体积得供试品溶液。

1.3.2 标准曲线的制作[7]

精确称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg，置于50 mL 棕色容量瓶中，用60 %的乙醇溶解并定容至刻度线，配得0.1 mg/mL 的芦丁标准溶液。精确量取该芦丁液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，分别加入5 %的NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再分别加入10 %的A（lNO）33溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；最后分别加入4 %的NaOH 溶液4.0 mL，用60 %的乙醇溶液定容至刻度线，摇匀，静置15 min。以相应试剂为空白，于505 nm波长处测定样液吸光度，并绘制芦丁标准溶液浓度C（mg/mL）与吸光度A 的标准曲线。

1.3.3 总黄酮含量的测定

精密吸取40 μL 供试品溶液置于10 mL 容量瓶中，按照“1.3.2”中方法测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算供试品中总黄酮的含量，并用下面的公式计算总黄酮的提取率：

1.3.4 精密度试验

精密吸取芦丁对照品溶液适量，按“1.3.2”方法重复测定6 次，RSD ＝0.31%。

1.3.5 稳定性试验

对同一份供试品溶液，每隔5 min 按“1.3.2”方法测定1 次含量，共测6 次，RSD＝1.12%，表明迷迭香提取液在30 min 内稳定。

1.3.6 加标回收试验

精密吸取已知含量的样品6 份，分别加入不同体积的芦丁对照品溶液，按“1.3.2”方法测定，平均回收率为99.81%，RSD＝2.78%。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

芦丁标准溶液在浓度0.002 mg/mL～0.016 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程y=9.685 7x-0.006 4，相关系数R2=0.999 1，x 为芦丁标准溶液浓度（mg/mL），y 为吸光度A。

2.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

精确称取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）分别加入浓度为40%、50%、60%、70%和80%的乙醇各40 mL，70 ℃回流提取3 h，结果见图2。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on yield of total flavonoids

由图2 可知，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率先增大而后减小。当乙醇浓度为50%时，总黄酮提取率最大。当乙醇浓度继续增加时，总黄酮提取率依次减小，这可能是由于一些脂溶性杂质、亲脂性强的成分溶出增多，导致黄酮类化合物的浸出减少。故选择50%乙醇为迷迭香总黄酮最佳提取浓度。

2.3 料液比对总黄酮提取率的影响

精确称取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）分别加入浓度50%乙醇，70 ℃回流提取3 h，结果见图3。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of total flavonoids

由图3 可知，随着提取溶剂的增加，总黄酮提取率先增大而后减小。当原料一定时，溶剂用量越多原料颗粒周围浓度越低，细胞壁内外浓度差越大，这样有利于有效成分的溶出。料液比为1 ∶20（g/mL）时，总黄酮提取率最大。当溶剂用量继续增加时，因溶剂挥发带来的损失会增大，导致提取率有所减小。故选择1 ∶20（g/mL）为迷迭香总黄酮最佳提取料液比。

2.4 提取时间对总黄酮提取率的影响

精确称取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入浓度50%乙醇，70 ℃分别回流提取1、2、3、4、5 h，结果见图4。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

由图4 可知，当提取时间为3 h 时，总黄酮提取率最大，继续延长提取时间，提取率反而略微减少，并趋于平稳，这可能是由于长时间浸提使得部分黄酮类化合物受热损失。故选择3 h 为迷迭香总黄酮最佳提取时间。

2.5 提取温度对总黄酮提取率的影响

精确称取2.000 g 迷迭香干粉5 份，按料液比1 ∶20（g/mL）各加入浓度50%乙醇，分别于50、60、70、80、90 ℃回流提取3 h，结果见图5。

图5 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids

由图5 可知，在80 ℃以前，总黄酮提取率随温度的升高而逐渐增大。当温度达到80 ℃时，提取率最大。随着温度的继续升高，总黄酮提取率反而下降，这是因为高温下溶剂挥发，浸提效果变差，同时部分黄酮类物质可能被破坏，导致提取率的减小。故选择80 ℃为迷迭香总黄酮最佳提取温度。

2.6 正交试验

选取乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度进行四因素三水平正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

由表2 可知，4 个因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为B＞C＞A＞D，即料液比＞提取时间＞乙醇浓度＞提取温度。提取条件的最优组合为A2B2C2D3，即乙醇浓度为50%，料液比为1 ∶20（g/mL），提取时间为4 h 和提取温度90 ℃。在此条件下，3 次重复试验，迷迭香总黄酮提取率达6.31%。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验设计及结果Table 2 The design and results of orthogonal test

3 结论

通过单因素及L（934）正交试验确定迷迭香总黄酮最佳提取工艺条件：乙醇浓度为50%，料液比为1 ∶20（g/mL），提取时间为4 h 和提取温度为90 ℃。在最佳提取工艺条件下，提取率为6.31%。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社,1986：1738-1739

[2]郑汉臣,蔡少青.药用植物学与生药学[M].北京：人民卫生出版社,2004：127-129

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