牡蛎多糖制备工艺优化及体外抑菌活性的探讨

田振华，李永斌，李颖，楚华航，郝丽丽，宿婷婷，张莉

（山东大学海洋学院，山东威海 264209）

多糖为一类天然产物，广泛存在于植物、微生物、动物等有机物中。多糖在临床上、食品工业、发酵工业以及石油工业有着广泛的应用[1]。同时随着海洋动物资源的进一步开发，海洋动物多糖由于其独特的结构和多种生物活性越来越受到人们的关注[2]。但是动物多糖抑菌效果的研究较少，目前鲜有报导出现。

牡蛎俗称海蛎子，是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类。牡蛎中含有海洋生物特有的多种活性物质，其中含有的多糖，具有调节机体免疫、抑制肿瘤、延缓衰老、降血糖、血脂、等生物活性[3]。但是关于牡蛎多糖抑菌性的研究却没有进行过。

实验采用滤纸片法对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性，旨在为动物多糖抑菌性研究提供思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

太平洋牡蛎：市售。

1.2 主要试剂

浓硫酸、重蒸苯酚、葡萄糖、无水乙醇、三氯乙酸、正丁醇、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

752 型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；PL303 电子分析天平：上海楚柏实验室设备有限公司；电热恒温水浴锅：龙口市先科仪器公司；FJ—200高速分散均质机：上海五久自动化设备有限公司；SC—3610 低速离心机：北京华辰乐天生物实验有限公司；RE-52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.4 实验方法

1.4.1 牡蛎多糖提取

新鲜牡蛎去壳，去一定量牡蛎，清洗匀浆，取牡蛎匀浆液加入到一定pH 水溶液中水浴提取，过滤离心，减压浓缩，以4 倍体积无水乙醇醇沉24 h，离心（3 500 r/min，20 min），95%乙醇、无水乙醇、丙酮依次洗涤离心物两次，烘干，得到牡蛎多糖干品。

1.4.2 酶法+sevag 法联合除蛋白[4]

在水提取液中首先加入0.2%菠萝蛋白酶于pH 为5.5，50 ℃下酶解3 h；然后调节pH 至8.5 加入碱性蛋白酶，在55℃下酶解4 h。将提取液置于90 ℃水浴10 min，灭活菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶。旋蒸液中加入sevag 液（氯仿∶正丁醇=4∶1，体积比），摇床震荡15min，离心弃去沉淀，多次用sevag 法除蛋白直到不再产生白色絮状沉淀。利用考马斯亮蓝G-250 方法测定蛋白含量[5]。

1.4.3 标准葡萄糖曲线的绘制[6]

1.4.3.1 葡萄糖标准曲线

精密称取干燥至恒重的葡萄糖标标准0.1 g 溶解稀释至1 L 容量瓶，配成0.1 mg/mL 的标准溶液。

1.4.3.2 硫酸苯酚法测定含量

在具塞玻璃管中，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的标准葡萄糖溶液，加入1 mL 6%的重蒸苯酚溶液，再加入5 mL 浓硫酸，并用蒸馏水定容至8 mL，摇匀，沸水浴15 min，冷却，于490 nm 处测定吸光度。

1.4.4 牡蛎多糖抑菌活性研究[7]

抑菌效果的检测采用纸片琼脂法，采用平板菌落计数法将受试菌在斜面培养基上活化2～3 代后，用接种环从斜面上轻刮菌苔一环，分别收集到内盛10 mL生理盐水的灭菌试管中，配成菌悬液备用。用打孔器将吸水力较强且质地均匀的双层滤纸打成直径为6 mm 的圆形，置于洁净干燥的试管内，121 ℃干燥灭菌20 min。将滤纸片置于等量的各不同浓度的多糖稀释液中浸泡1 h，吸取菌液0.2 mL，将其均匀地涂布于平板表面，每个培养皿均分为四部分，将滤纸片放置在相应部分。并用蒸馏水浸泡作为空白对照。在37 ℃下，培养24 h，观察多糖溶液的抑菌情况，并测量抑菌环直径。每种菌重复试验3 个平板，计算其平均值。

2 结果

2.1 葡萄糖标准曲线

由紫外可见得到的葡萄糖标准曲线表1。葡萄糖标准曲线回归方程为：y=6.782 1x-0.008 8，线性良好R2=0.997 9。

表1 葡萄糖标准曲线Table 1 The table of making standard curve

根据表1 得到多糖含量为77.14%，经过除蛋白后蛋白含量下降至1.21%，可以认定蛋白对试验影响较小。

2.2 牡蛎多糖提取正交试验提取

牡蛎多糖正交试验提取：根据各试验因素的水平试验结果，选定以pH、提取温度、提取时间、提取次数、料液比作为试验因素设计五因素、四水平的正交试验，对牡蛎多糖的提取工艺进行优化，提取的正交试验因素与水平如表2 所示，提取的正交试验结果见表3。

表2 提取的正交试验因素与水平Table 2 Factors level table of orthogonal experiment

表3 提取的正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3 分析多糖提取最佳条件为：A4、B2、C2、D3、E3，即：pH 为8.0、温度为65 ℃、时间为4 h、次数为3次、料液比为1 ∶15 mg/mL，各因素对多糖提取率的影响顺序为：pH＞时间＞料液比＞次数＞温度。用该工艺提取银条多糖的工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好。

2.3 抑菌效果

0.02 mg/mL 金黄色葡萄球菌抑菌效果对比见图1、图2，同浓度的多糖对枯草芽孢杆菌抑菌效果对比见图3、图4，由于多糖对大肠杆菌抑菌效果较弱，因此较高浓度0.08 mg/mL 多糖对大肠杆菌抑菌效果对比见图5、图6。

图1 0.02 mg/mL 多糖对金黄色葡萄球菌抑菌图Fig.1 0.02 mg/mL polysaccharide on Staphylococcus aureus bacteriostatic diagram

图2 对照组金黄色葡萄球菌Fig.2 Control group of Staphylococcus aureus

图3 0.2 mg/mL 多糖对枯草芽孢杆菌抑菌图Fig.3 0.2 mg/mL polysaccharide on Bacillus subtilis bacteriostatic diagram

图4 对照组枯草芽孢杆菌Fig.4 Control group of Bacillus subtilis

图5 0.8 mg/mL 多糖对大肠杆菌抑菌图Fig.5 0.8 mg/mL polysaccharide on Escherichia coli bacteriostatic diagram

图6 对照组大肠杆菌Fig.6 Control group of Escherichia coli

2.4 抑菌圈直径

不同浓度牡蛎多糖溶液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径见表4。

表4 不同浓度的牡蛎多糖溶液对细菌的抑菌圈直径Table 4 The effect of oyster polysaccharide on the diameter of inhibition zone

由表4 可知，牡蛎多糖对以上3 种菌类都有一定的抑制效果，其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最佳，枯草芽孢杆菌效果次之，对大肠杆菌抑制效果最弱。

3 分析讨论

1）多糖提取过程中优化了提取的温度、pH、提取时间、次数、料液比等问题，根据各因素的影响情况，得到多糖提取最佳条件，但是实际操作中，从能源角度出发，多糖提取可以适当增加单次提取时间，以减少提取次数、温度因素。

2）多糖抑菌的机理尚不明确，但是普遍认为主要是抑制细菌或者真菌细胞新陈代谢重要环节或者酶系统[8]，根据抑制代谢环节的不同其抑菌效果也有不同。实验中抑制金黄色葡萄球菌效果强于枯草芽孢杆菌强于大肠杆菌。因此可能的原因是：牡蛎多糖能够对细菌细胞膜产生影响，改变细胞膜流动性和通透性，破坏细胞细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，起到抑菌效果；也有可能是多糖作用于细菌细胞壁影响细菌新陈代谢。

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