印迹水凝胶作为氟尿嘧啶载体的药物缓释性能

阚文涛，李 欣，罗顺忠，胡 睿

（1中国工程物理研究院核物理与化学研究所，四川 绵阳 621900；2哈尔滨工业大学化学系，黑龙江 哈尔滨 150001）

分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT），是制备对特定的某一目标分子（模板分子）具有特异性识别的聚合物的一项技术，属于超分子化学的研究领域。运用该技术可以制备出具有识别位点且在三维空间结构上能与目标分子完全匹配的三维孔穴的聚合物，由于模板分子的存在，功能单体与模板分子以互补的形式固定下来，除去模板后的聚合物能专一性识别模板分子或与其有类似分子结构的分子，该聚合物被称为分子印迹聚合物。水凝胶是具有线性高分子链通过交联而形成的三维网状结构，具吸水性，经大量溶剂溶胀而形成的胶态物质。

将分子印迹技术引入到凝胶中，是一种新兴的药物缓释方法，使凝胶网络具有对大分子的记忆功能，通过药物与凝胶网络中多种功能基团的相互作用来延缓药物的释放。对药物缓释效果贡献较大的是对药物分子结构具有记忆功能的孔穴，而并非因凝胶体积膨胀而在凝胶聚合物网络链间所产生的较大自由空间。要制备对模板药物具有高亲和力的凝胶网络，需要考虑药物作用位点的数目及其与药物相互作用的强度、聚合网络的结构以及聚合物链的可动性。分子印迹技术与水凝胶载药体系的结合可以进一步增强其效果，一方面印迹技术可以模拟生物酶及抗体，具有成为其替代品的潜质；另一方面，印迹位点的存在提高了凝胶的载药量，同时也使得反馈调节给药系统具有更长的治疗周期。

有很多文献报道用于缓释氟尿嘧啶的药物载体材料，报道的这些药物载体材料多基于多糖和多肽，其通常能够协同增加氟尿嘧啶的药效[1]。以分子印迹技术为技术手段控制释放氟尿嘧啶的报道较少，有文献报道合成了氟尿嘧啶的印迹聚合物，但该聚合物只供分析之用[2]，应用分子印迹聚合物作为氟尿嘧啶药物缓释载体的物质形态主要是粉末以及微球[3]。

本工作采用分子印迹技术，以甲基丙烯酸羟乙酯为骨架单体，以甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂制备印迹水凝胶作为氟尿嘧啶的药物缓释载体。甲基丙烯酸羟乙酯作为骨架单体，从其官能团上看应与氟尿嘧啶有较强的作用，但是对于某些药物，甲基丙烯酸羟乙酯的均聚物作为载体对其负载量很有限[4]。甲基丙烯酸羟乙酯作为骨架单体存在于凝胶中，分布在功能单体甲基丙烯酸周围，提供微环境使甲基丙烯酸对氟尿嘧啶具有足够的亲和力[5]。图1所示为制备的印迹水凝胶模板药物与各单体的相互作用情况。

采用凝胶负载氟尿嘧啶以提高药物的生物相容性，减小其毒性，并研究凝胶对氟尿嘧啶的缓释性能。制备全过程理论上所有反应原料均生成产物，全过程中没有使用有机溶剂，有效避免有机溶剂在药物载体中的残留，减小其毒性。

1 实验材料与仪器设备

1.1 主要试剂

偶氮二异丁腈、甲基丙烯酸为天津市天大化学试剂厂；甲基丙烯酸羟乙酯，乙二醇二甲基丙烯酸羟乙酯，氟尿嘧啶均为Alfa Aesar化学有限公司。

1.2 主要仪器

图1 单体与模板药物作用示意图

AEU-210电子天平（灵敏度 0.0001 g），日本shimadzu公司；电热真空恒温干燥箱，中国巩义市予华仪器有限责任公司；KS-3000超声波清洗机，中国宁波KE Sheng仪器厂；SHB-95型循环水真空泵，中国郑州杜甫仪器厂；S4800HSD扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；1100型高效液相色谱，美国Agilent公司；Avatar360型傅里叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；紫外-可见分光光度计，中国北京普析通用公司；ZRY-2P型差热、热重综合热分析仪，上海天平仪器总厂。

2 实验方法

2.1 印迹水凝胶的制备

（1）将0.034 mL的甲基丙烯酸及0.113 mL乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于4 mL的甲基丙烯酸羟乙酯中，超声震荡使各反应物混匀，加入模板药物氟尿嘧啶，使氟尿嘧啶与甲基丙烯酸的摩尔比分别为1∶4，1∶8，在温水环境中超声振荡，直到药物完全溶解，将得到的澄清透明有机溶液静置充分，使功能单体与模板药物充分作用，通过氢键形成配合物，向体系内通入N2使体系无氧，密封后50 ℃恒温反应12 h，后70 ℃恒温反应24 h，反应后得到无色透明固体。非印迹水凝胶除不加魔板药物外制法同上。

（2）将产物于去离子水中反复洗涤，直到凝胶中未反应的功能单体、交联剂、骨架单体、模板药物全部被洗去。

（3）将洗好的水凝胶于40 ℃真空干燥48 h，得到无色透明、表面光滑的固体备用。

2.2 印迹水凝胶的吸水溶胀性能

称取干燥的非印迹水凝胶，已洗去模板分子的干燥的印迹水凝胶（8∶1）及印迹水凝胶（4∶1）各0.2 g，于去离子水中浸泡24 h，时间到后称取其吸水后的质量。

称取一定质量的厚度约为1 mm的水凝胶，分别浸入pH值分别为6.86和9.18的缓冲溶液体系中震荡，并在不同时间点称取凝胶质量，计算出其在不同时刻的每单位质量的水凝胶吸入溶剂的量。

将一定质量的厚度约为1 mm的水凝胶分别浸入pH=9.18，pH=6.86缓冲溶液中并震荡24 h，比较溶胀前后水凝胶的质量。

2.3 凝胶负载药物性能

称取干燥的非印迹水凝胶，已洗去模板分子的干燥的印迹水凝胶（8∶1）及印迹水凝胶（4∶1）各0.2 g，浸于高浓度的氟尿嘧啶溶液中，震荡72 h，用紫外吸收光谱于267 nm处测量吸附前后溶液的浓度，并根据吸附前后体系中氟尿嘧啶含量的变化计算单位质量的凝胶对模板药物的负载量。由于有文献报道以甲基丙烯酸为功能单体，甲基丙烯酸羟乙酯为骨架的印迹水凝胶在纯水中吸附模板药物的效果最佳[4]，故实验选用超纯水为吸附药物的媒介。

2.4 水凝胶释放药物性能

（1）将印迹水凝胶（8∶1），印迹水凝胶（4∶1）及非印迹水凝胶浸泡于氟尿嘧啶溶液中，并震荡72 h。

（2）时间到后弃去氟尿嘧啶溶液，加入释放介质pH=6.86的磷酸缓冲溶液清洗数次以洗去在凝胶表面的但未特异性吸附的氟尿嘧啶。

（3）向体系内加入10 mL的释放介质pH=6.86的磷酸缓冲溶液并开始震荡，并在20 min，50 min，80 min，140 min，200 min，260 min，320 min，分别从体系中取出等量的样品待测，计算时以20 min为起点计算药物从凝胶中的释放量。

3 结果与讨论

3.1 SEM表征印迹水凝胶

图2 印迹水凝胶的扫描电镜图

从图2可以看出：印迹水凝胶表面平整、光滑。出现该表面形貌的主要原因是水凝胶的主要组成成分为骨架单体甲基丙烯酸羟乙酯，功能单体甲基丙烯酸及交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯的含量较少，在水凝胶中的浓度分别为0.1 mol/L及0.16 mol/L，能够吸附模板药物的位点高度分散在由骨架单体聚合而成的大环境内。

3.2 光谱表征印迹水凝胶

从红外表征可以看出（图3），1638 cm−1处未出现明显的碳碳双键的伸缩振动吸收峰，说明反应相对进行完全，而且在合成后的去离子水清洗过程中已将未反应的残留单体清除完全，处理后的水凝胶体系中已经不存在尚未反应的功能单体、交联剂和骨架单体。经过去离子水反复清洗的该水凝胶中已不存在碳碳双键作为活性位点，使得水凝胶医学相容性好，细胞毒性低[6]。3440 cm−1为羟基的伸缩振动吸收峰，该峰宽而强，说明以该方法制备出的水凝胶可以以羟基通过很强的氢键作用与模板药物氟尿嘧啶结合，从而负载一定量的药物。

3.3 DSC表征印迹水凝胶

分别对模板药物氟尿嘧啶、制备出的印迹水凝胶和非印迹水凝胶进行DSC表征，温度区间为0～400 ℃，升温速度为10 ℃/min。结果见图4。

图3 印迹水凝胶的红外谱图

图4 DSC分析

可以用DSC表征的结果说明在固溶体中某物质是否与其它的物质通过氢键结合成配合物，氟尿嘧啶在温度达到 287 ℃时有剧烈的热量变化，说明其在该温度点熔化，而印迹水凝胶在该温度点没有相应的热量变化，说明在其中模板药物氟尿嘧啶与其它组分通过氢键作用结合成了配合物，由于键合的作用使得药物在温度达到其熔点后不再产生相变。

3.4 吸水溶胀性能

3.4.1 不同配比的印迹水凝胶及非印迹水凝胶溶胀率

如图5所示，吸水溶胀实验前后的凝胶质量比分别为：1.5824，1.598，1.7035。印迹水凝胶（4∶1）的吸水溶胀性能最佳，其次为印迹水凝胶（8∶1），非印迹水凝胶最差。造成这种差别的原因是随着合成印迹水凝胶过程中模板药物用量的增多，洗去模板药物后在凝胶中留下的孔穴也相对多，在液体环境中时溶剂更容易渗透进入凝胶中。

依据不同的共聚物组成，凝胶厚度以及负载药物量的不同，多样的水凝胶吸水溶胀动力学及药物释放动力学都在文献中报道过[7-8]。关注水凝胶的吸水溶胀性能是因其将直接影响药物从其中释放的速率，凝胶的水化就像温度升高一样影响着其从玻璃态到高弹态的转化，从而改变凝胶的力学性能。

3.4.2 同一类型水凝胶在不同pH值体系中吸入溶剂动力学曲线

如图6所示，凝胶浸入体系中后即开始吸入溶剂，起初溶剂进入凝胶的速度很快，在约6 h后凝胶吸入溶剂速度变缓，达到饱和；同时在 pH=9.18的缓冲溶液中凝胶在任意时刻摄入的溶剂量明显大于其在pH=6.86缓冲溶液中的相应值，表明在高pH值环境下凝胶更容易溶胀。

3.4.3 同一类型水凝胶在不同pH值体系中的溶胀率

如图7 所示，在pH=9.18的缓冲溶液中凝胶溶胀前后质量之比为1.525，而在pH=6.86缓冲溶液中为1.493，在pH值较高的环境中凝胶更容易溶胀。

图5 非印迹水凝胶，印迹水凝胶的吸水溶胀率

图6 凝胶吸水动力学曲线

图7 凝胶在不同pH值环境中的溶胀率

3.5 凝胶负载药物性能研究

如图8所示，非印迹水凝胶在此条件下的载药量为0.0692 mg/g，印迹水凝胶（8∶1）及印迹水凝胶（4∶1）的载药量分别为 0.0914 mg/g，0.0818 mg/g。两种配比的印迹水凝胶单位质量的载药量均高于非印迹水凝胶，同时印迹水凝胶（8∶1）比印迹水凝胶（4∶1）负载更多的药物。

功能单体甲基丙烯酸与氟尿嘧啶的作用方式被认为是甲基丙烯酸的羧基通过离子键或者氢键与氟尿嘧啶中的氨基、羰基及氟原子作用，当功能单体和交联剂在凝胶中的含量固定时，当合成时所用氟尿嘧啶的量多于刚好可以形成完好孔穴的用量时，用于吸附氟尿嘧啶的位点虽然可以形成，但此时并不能形成足够多的识别位点与氟尿嘧啶上的所有功能基团发生作用，孔穴与氟尿嘧啶的亲和性无法达到理想状态，从结果上看当凝胶在药物溶液中时，其表面对药物的吸附与解吸平衡过程倾向于解吸药物，体现为此时凝胶对药物的负载量相对较小。相反，当功能单体与模板分子的配比刚好时，更多的功能单体聚集并形成具有较高多点结合常数的有效的孔穴，能对药物发挥更好的吸附作用。

图8 水凝胶负载药物量示意图

印迹水凝胶（8∶1）药物负载量大于印迹水凝胶（4∶1），原因为当甲基丙烯酸的用量为氟尿嘧啶的8倍时，在凝胶中刚好能形成完好的吸附孔穴，当氟尿嘧啶的用量加倍后，属于上面所分析的情况，致使出现了实验呈现出的结果。

制备印迹水凝胶的过程中，功能单体与模板药物的配比，及功能单体在骨架单体中的浓度均会影响凝胶对药物的释放速率，考虑到氟尿嘧啶在甲基丙烯酸羟乙酯中的溶解度，使甲基丙烯酸在骨架单体中的浓度为0.1 mol/L。

3.6 凝胶释放药物的累积释放百分数

从图9 中可以看出，印迹水凝胶对药物的缓释效果明显好于非印迹水凝胶，同时印迹水凝胶（8∶1）在整个过程中对药物的释放平缓，没有出现在某一阶段突释药物或停止释放的现象，相比之下印迹水凝胶（4∶1）以及非印迹水凝胶对药物的释放不均匀，作为药物载体材料应用时对药物的突释及某段时间停止释放药物都会给治疗带来副作用。

由于合成非印迹水凝胶时未加入模板药物，所以在其中不存在印迹孔穴，所有功能单体上的作用位点在凝胶表面无规律排列，其作用比印迹孔穴中的位点弱，使得非印迹水凝胶对药物的释放速度快，而且释放曲线也没有规律性。印迹水凝胶（8∶1）对药物释放较缓和，释药速率不断减小，在其中识别位点的数目刚好可以与氟尿嘧啶上的功能基团充分作用，更接近于形成完好孔穴，而印迹水凝胶（4∶1）中甲基丙烯酸的用量多于形成吸附氟尿嘧啶的完好孔穴所需的量，多余的功能单体作用位点在凝胶中杂乱排列，这些杂乱排列的位点虽然也能吸附药物，但进入释放介质中时其对药物的吸附作用没有印迹孔穴中的位点强，更容易释放其吸附的药物，同时由于作用位点的不规律排列，对药物的作用也不规律，使其释药曲线出现释放停滞现象，释药过程不规律。

图9 水凝胶释放药物曲线

3.7 印迹水凝胶药物释放量

图10为每小时印迹水凝胶（8∶1）氟尿嘧啶释放量的示意图，在凝胶释药的最初5 h内，每小时分别从凝胶中释放出氟尿嘧啶 1.746 µg，0.924µg，0.432 µg，0.170 µg，0.104 µg，单位时间内从凝胶中释放的药物量缓慢减少。

在释放介质中，药物从水凝胶中的释放是解吸与吸附之间的竞争过程，最初释放介质内药物量为零，负载在凝胶上的药物倾向于解吸从而释放到介质中，介质中的氟尿嘧啶含量在释放过程中逐渐增加，使凝胶上药物的解吸动力逐渐减小，药物从凝胶上释放的速度逐渐减小。当介质中氟尿嘧啶的含量达到一定值时，药物将难以从凝胶释放到介质中。

3.8 负载药物环境的药物浓度对水凝胶释药行为的影响

在pH=6.86的磷酸缓冲溶液中，分别研究在低、高两浓度的氟尿嘧啶溶液中达到药物吸附释放平衡的水凝胶的药物释放行为见图11。从图11可以看出：在高氟尿嘧啶浓度下达到吸附平衡的印迹水凝胶药物的释放量较大，主要原因是在较高氟尿嘧啶溶液中达到平衡的印迹水凝胶负载的药物量较大，识别位点对药物的作用相对较弱。

图10 印迹水凝胶每小时药物释放量

图11 印迹水凝胶释放药物曲线

3.9 释放介质的pH值对凝胶释放药物的影响

将印迹水凝胶（8∶1）于氟尿嘧啶溶液中吸附药物72 h，时间到后弃去氟尿嘧啶溶液，加入释放介质pH=9.18的缓冲溶液清洗数次以洗去凝胶表面非特异性吸附的氟尿嘧啶。向体系内加入 10 mL pH=9.18的缓冲溶液作为释放介质并开始震荡，在20 min，50 min，80 min，110 min，170 min，230 min，290 min分别从体系中取出等量的样品待测，以20 min为时间起点计算凝胶的药物释放量，见图12。

由图12可见，在pH=9.18的释放介质中水凝胶的药物释放速度更快，凝胶对氟尿嘧啶的缓释性能有所下降，主要原因为体系pH值的提高使凝胶中负载氟尿嘧啶的位点羧基离子化，与药物的作用被削弱，导致药物从凝胶中的释放速率加快。

4 结 论

本文以抗癌药物氟尿嘧啶作为模板药物，制备印迹水凝胶，得出如下结论。

图12 印迹水凝胶释放药物曲线

（1）对凝胶进行扫描电镜、差示扫描热量法及红外谱图表征，结果显示印迹水凝胶表面光滑、无孔，氟尿嘧啶在其中与各单体通过氢键形成配合物，同时凝胶内无未反应单体残留。水凝胶的吸水溶胀性能随制备中模板药物的含量的增加而增强，同时同一凝胶的溶胀速度与溶胀率随体系pH值的升高而增强。

（2）水凝胶具有对氟尿嘧啶的负载能力，当功能单体与模板药物摩尔比为8∶1时，其负载药物能力最强，负载量为0.0914 mg/g，并且负载量随体系中氟尿嘧啶浓度的增加而增加。

（3）在模拟体液中印迹水凝胶对药物的缓释作用明显优于非印迹水凝胶，并且印迹水凝胶（8∶1）对药物的缓释效果优于印迹水凝胶（4∶1），对药物的释放平缓，凝胶原载药量的提高及环境 pH值的提高均可加快印迹水凝胶的药物释放过程。

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