发酵乳制品中益生菌生存能力影响因素的研究进展

文 / 周晓丹 张 昊 郭慧媛 任发政

（中国农业大学教育部-北京市共建功能乳品重点实验室）

1 前言

在世界范围内，消费者对食品影响健康的意识逐渐增强，这也使得功能食品的消费成为一种趋势。2000年、2005年和2010年，功能性食品在全球的市场份额分别为330 亿、735 亿和1 670 亿美元[1]。益生菌食品被视为功能食品市场的一个重要组成部分，占市场总量的60%～70%。益生菌是可能存在于宿主（人类/动物）肠道中的活的微生物（不包括霉菌），具有确定的一种或多种益生功能。乳酸杆菌和双歧杆菌是目前发酵乳制品中最常使用的菌种。发酵乳制品中很多常见的益生功能都来自于益生菌，其中普遍承认的作用有抗癌、抗诱变、刺激免疫系统（免疫调节）、抗感染，降低血清胆固醇，缓解乳糖不耐症以及增强营养[2]。

根据食品法典委员会的定义，发酵乳制品是一种“通过发酵鲜奶得到的乳制品，产品可能会经过合适的微生物的作用而使组分改性，从而降低了pH值，产生凝乳现象（等电点沉淀）”[3]。发酵乳制品在全世界广泛制造，大约有400 个通用名称被应用到传统和商业产品中。但这其中实际的产品种类可能只有少数几种，酸奶是世界上最受欢迎的发酵乳制品[4]，其它的发酵乳制品还有发酵奶酪，基于发酵乳的饮料（如酸乳酒，马奶酒，Ayran酸奶汁，Doogh酸奶饮料），经发酵的冰淇淋，发酵乳制品甜点以及酸奶油等。

对于一个益生菌产品，发挥其益生功能，直到保质期最后益生菌仍保持较强的活力，是其品质最关键的评价准则[5，6]。虽然全球没有公认的产品中益生菌的最小含量标准，但通常浓度为106CFU/mL和107～108CFU/mL（或CFU/g）分别是被普遍接受的最小和令人满意的剂量水平[3，5，7]。在发酵乳制品生产和贮存过程中，益生菌的生存能力受配方、生产工艺和环境条件等诸多因素的影响[8～10]。本文对这些影响益生菌生存能力的主要因素进行了概述。

2 益生菌菌株和发酵菌株间的生物关系

由于益生菌无法在充分发酵的同时又保证发酵乳制品令人满意的感官品质，所以通常会在其中添加传统的发酵菌种，这被称为“支持培养”或“辅助培养”。益生菌在牛奶中生长缓慢会提高有害微生物生长的风险，而且若菌株生长不良，也可能会产生不愉快的味道[5]。只添加益生菌的发酵乳制品，其培养时间可能会延长到8～24 h，而使用传统发酵菌株只需要3～4 h[11]。因此，发酵功能食品最需要关注的就是发酵剂和益生菌之间的相互作用。

针对不同的益生菌，发酵菌株与益生菌菌株之间会呈现协同或拮抗两种作用，这取决于二者的种类以及组成成分和工艺条件[12]。通过产生一些促进益生菌生长的物质或消耗某些抑制因素，发酵菌株可以为益生菌提供一个良好的生长环境。然而，益生菌的生存可能会受到包括乳酸、过氧化氢、细菌素，甚至是挥发性化合物在内的发酵菌株代谢产物的影响[13]，保加利亚乳杆菌在发酵过程中会急剧产酸，然后在冷藏过程中继续缓慢产酸（后酸化过程）。上述现象均会导致酸奶产生不愉快酸味，同时降低益生菌的生存能力[5]。因此，在决定发酵乳制品培养成分时，最主要的原则是选择兼容且合适的益生菌混合物和发酵剂。

选择用于食品生产的益生菌菌株应考虑其对产品的兼容性和拮抗性两个标准[4]。乳酸杆菌和双歧杆菌是目前用于发酵益生菌酸奶最重要的菌种。两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌、约氏乳杆菌、洛德乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、代田乳杆菌、乳酸肠球菌、小球菌等目前都可用于生产益生菌发酵乳制品，其产品包括酸奶、酪乳、酸乳酒和马奶酒等[14，15]。益生菌在产品中（对pH值、总酸含量、氧气毒性、冻结、低温或相对较高的储存温度等恶劣条件的抵抗）和生活消费条件下的耐受性依赖于菌株本身的特异性[16～19]。双歧杆菌是严格厌氧菌，高氧含量会影响其正常生长和活性，然而由于其对于酸、低pH值和分子氧等有害环境因素的良好耐受能力，乳双歧杆菌虽然并不来自于人类，却是发酵乳制品中最常用的双歧杆菌菌株[20]。

3 发酵乳制品中对益生菌有害的因素

3.1 低pH值和总酸含量

低pH值和总酸含量是影响发酵乳制品中益生菌生长和稳定性的重要因素。嗜酸乳杆菌最适生长的pH值为5.5～6.0，而双歧杆菌为6.0～7.0[9]。当pH值低于5.5时，嗜酸乳杆菌细胞的生长会明显减慢[7]。然而，双歧杆菌属的某些菌种对酸的耐受能力是有菌株特异性的。氢离子会中断通过细胞膜的质量传递，并导致细胞酸性饥饿，从而对益生菌细胞造成损害[5]。发酵乳制品中过低的pH值可能会引起非游离态有机酸浓度的升高，从而增强了这些酸的杀菌作用。

发酵乳制品中的酸含量与氧化还原电位值呈正相关，而氧化还原电位值越高对双歧杆菌的活性越不利[12]。通常在发酵乳制品中，相比于总酸含量，益生菌对pH值相关的压力更为敏感（pH值和pH值下降速率）。总酸含量主要是在储存过程中对益生菌活性的影响较大[21，22]。

3.2 溶解氧和过氧化氢

乳酸杆菌可以好氧或厌氧并严格发酵，而双歧杆菌则严格厌氧并可分解糖类[9]，因此，分子氧不利于益生菌的生长和存活。然而，对氧的敏感性在不同菌种和菌株之间差别很大。一般情况下，乳酸杆菌本质上是微量需氧微生物，对氧的耐受性强于双歧杆菌。

氧在三个方面影响益生菌的培养。首先，它对一些细胞有直接毒性；第二，某些益生菌培养在有氧条件下，特别是像保加利亚乳杆菌，会产生对益生菌细胞有毒性的过氧化物，这也是嗜酸乳杆菌在ABY型酸奶（特指其发酵所用菌种为嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的酸奶）发酵和储存过程中活性损失的主要原因[23，24]；第三，各种成分氧化作用产生的自由基（如脂肪）对益生菌细胞也是有毒性的[5，22]。有许多方法可以降低发酵乳制品中的氧含量，最主要的便是在真空下完成发酵。使用真空包装和对氧气渗透性低的包装材料，在牛奶中添加抗氧化剂和除氧剂（如抗坏血酸），并控制生产过程，这样可以使溶解氧的含量达到最小值[25]。

3.3 添加剂

目前乳品行业中使用的食品添加剂会显著影响发酵剂（如嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌）和益生菌（如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌）的生长和活性[26]。这些添加剂包括盐（NaCl和KCl）、糖（蔗糖和乳糖）、甜味剂（安赛蜜和阿斯巴甜）、芳香化合物（二乙酰、乙醛和乙偶姻）、天然色素、调味剂、调味着色剂、乳酸链球菌素、那他霉素和溶菌酶等[4，26]。

研究证明，益生菌对乳品添加剂的耐受性比发酵菌更强[27]。当NaCl达到一定的浓度（如0.5%～1.0%）时即会对益生菌生长和活性产生刺激作用[28]。添加精油也不利于益生菌的生存，在储存期间，浓度为0.2%的薄荷和新塔花香精即可导致嗜酸乳杆菌LA-5和乳双歧杆菌BB-12活菌数量的显著减少[4]。

4 发酵乳制品中促进益生菌生长的因素

4.1 生长因子和生长促进剂

由于缺少非蛋白氮和一些维生素，以及β-半乳糖苷酶和蛋白水解酶缺乏活性，乳酸杆菌，特别是双歧杆菌在牛奶中容易生长不良[18，25]。为解决生长缓慢的问题，通用的一个很好的方法就是使用各种生长因子和生长促进剂来强化牛奶，如酪蛋白、乳清蛋白水解物、L-半胱氨酸、酵母提取物、葡萄糖、维生素、矿物质和抗氧化剂等。这些补充物对益生菌的存活有显著的促进作用[25]。由于蛋白质衍生物对细胞的营养价值，以及降低培养基的氧化还原电位和增加培养基的缓冲能力等特性，其促进益生菌生长的作用最为显著。“益生元”是不易消化的食品配料，会被肠道内的有益菌选择性代谢以促进其生长。它们大多是二碳到十碳的低聚糖类化合物，在很大程度上能抵抗胰腺和刷状缘酶的消化，有助于保持益生菌在产品及肠道内的生存能力[21]。

4.2 产品中的益生菌保护因素

产品的缓冲能力，以及其固体基质特性可以显著影响益生菌细胞的生存能力。由于其将pH值维持在了较高水平，因此增加牛奶的缓冲能力可增强益生菌的活性。此外，高缓冲能力产品的pH值在发酵和冷藏过程中下降缓慢，使益生菌细胞的存活率更高[13，28]。奶酪和酸奶缓冲能力很强，益生菌在其中的生存能力也远高于发酵乳饮料。另外还可以通过添加小麦、大麦和麦芽提取物到牛奶中来增加产品的缓冲能力[29]。

与液体食品不同，产品中的固体基质，如酸奶或奶酪的凝胶结构，则通过减少其暴露于有害因素中的机会来保护益生菌细胞[4，22]。这些基质可作为物理或化学屏障阻断H+和有机酸这类水相环境的不利因素[28]。另有报道指出，通过在食品原料中形成致密基质，乳酸菌胞外多糖也可提高益生菌在胃肠道中的生存能力[30]。

5 发酵乳制品加工工艺对益生菌的影响

5.1 发酵温度和时间

发酵温度和时间是影响益生菌生存能力最重要的因素。虽然嗜酸乳杆菌可在高达45 ℃条件下生长，但其最适温度为40～42 ℃，双歧杆菌最适生长温度为37～41 ℃，发酵菌种则为42～45 ℃[31]。混合益生菌培养，特别是发酵菌种与益生菌共同培养时，选择适当温度更加重要。研究表明，在ABY型培养组分中，发酵温度过高，益生菌生存能力越低，这是因为高温下发酵菌种比益生菌生存能力更强[24，31]。

5.2 接种条件

在进行不同种类的发酵时，接种条件也不同，包括发酵后接种、连续发酵和单独发酵。益生菌发酵乳制品中添加发酵剂可提高发酵速率，并产生酸奶特有的风味和质地。然而，益生菌和发酵菌种共同培养会降低益生菌的生存能力，这是因为发酵过程中发酵菌种生长更快，而且会产生一些物质抑制益生菌生长。为克服此问题，可在发酵后加入益生菌，即“发酵后接”，使用这种方法，培养时间显著缩短[4，32]。此外，也可以让益生菌和发酵剂先分别单独生长，然后再将两者混合[5]。这样可以使益生菌增殖到理想数量，又不会影响发酵剂的发酵过程。然而，一些证据表明，发酵后接种益生菌，会降低其耐受性，并使其暴露于环境压力中，这又会反过来导致益生菌细胞生存能力大量损失[5，22，28]。

在连续发酵中，益生菌比发酵菌种增殖更快，或二者在适宜温度下同时增殖。在“两步式发酵”过程中，初始为益生菌培养，然后再由一种或两种发酵剂完成发酵，使益生菌在最终达到停滞期或在初始阶段达到对数期。此过程结束时会得到一个相当高的益生菌数量，而发酵时间会稍长[33]。连续发酵过程可以改变发酵温度，37 ℃开始让益生菌生长，然后逐步升温至40 ℃、42 ℃或44 ℃来改善风味和质地[22]。

接种量会影响益生菌生存能力、发酵时间以及最终产品的感官品质。益生菌与发酵剂间的接种比率是一个关键因素。发酵剂和益生菌之间以较低比例接种会延长发酵时间，感官性状也不理想。相反较高比例则会使发酵菌种大量生长，保加利亚乳杆菌的过度酸化现象也会降低益生菌生存能力[4，13，22]。然而，在缺乏营养的培养基上过度提高接种量可能会导致相反结果，由于营养竞争和拮抗作用，发酵剂生存能力会下降。除了接种量，培养液中的活细胞浓度也应加以考虑，接种量恒定时，增加培养液的活细胞浓度，产品中细胞数量也会提高[13]。

5.3 储存温度和时间

由于温度对细胞存活有影响，因此发酵乳制品的贮存温度会影响益生菌的生存能力，以及发酵菌种代谢物的类型和浓度[34]。有报道指出ABY型酸奶在2 ℃条件下存储20 天，其嗜酸乳杆菌LA-5活性达到最高，而乳双歧杆菌BB-12在8 ℃条件下储存会获得最大活性。已经证实双歧杆菌细胞在低储存温度下（2 ℃以下）抵抗力较低[35]。所以益生菌发酵乳制品应存储在冷藏温度下，优选4～5 ℃。

存储时间与益生菌的生存能力成一定的比例，因为时间延长增强了有害因素对益生菌的不利影响。尽管益生菌对于恶劣环境的抵抗力有菌株特异性，发酵乳制品pH值低于4.2时（如许多发酵乳饮料），要实现每个益生菌菌株活菌数量都保持在107CFU/mL以上，且保质期超过21 天是很难的[34]。相比发酵乳饮料，具有高pH值（4.4～4.6）和高缓冲力的益生菌酸奶，则可以实现更长的保质期。高于5 ℃存储保质期超过约3 周的ABY型酸奶，可能会导致保加利亚乳杆菌大量生长，这种后酸化作用会显著降低益生菌的生存能力[34]。

6 小结与展望

发酵乳制品是健康食物，益生菌会产生额外的健康功效。益生菌发酵乳制品是现在最受欢迎的食品。对于这种产品，发酵是关键环节，它是由益生菌单独或辅助发酵剂共同作用实现的。益生菌被添加到发酵乳制品中，其许多特性与最终产品的质量和属性有关。这些特性包括益生菌细胞的安全性，生产和储存过程中益生菌的生存能力，益生菌与发酵剂的酸化速率，以及其生产出具有优良感官品质和合理价格的产品的能力。现有的大量研究都是针对产品配方和生产工艺的优化，而益生菌在发酵乳制品中的生存能力更是保证产品品质和性能的关键所在。未来发展前景必将是基于分离新的益生菌菌株，改造修饰现有益生菌和发酵剂并不断完善配方和工艺，以获得其良好的生存活力以及更好的健康功效，关于诸如益生菌和益生元微胶囊化等新技术的研究也会受到特别关注。

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