肝素衍生物的抗凝血活性评价

王 莺*

（南方医科大学基础医学院肿瘤研究所，广东 广州 510515）

肝素衍生物的抗凝血活性评价

王 莺*

（南方医科大学基础医学院肿瘤研究所，广东 广州 510515）

目的评估一系列化学修饰肝素衍生物的抗凝血活性。方法应用凝血仪测定肝素的部分活化凝血活酶时间（APTT）-肝素浓度的标准曲线，应用酶标仪测定肝素抗Ⅹa因子活性，制定其在405nm的吸光度-肝素浓度标准曲线，然后分别测定肝素衍生物的APTT和抗Ⅹa因子活性，根据标准曲线评价肝素衍生物的抗凝活性。结果化学修饰能够适当降低肝素衍生物的抗凝血活性，并且随着引入的有机基团的增多，肝素衍生物的抗凝血活性逐渐下降，但仍然保持一定的生物活性，且应用APTT评估肝素衍生物抗凝活性与应用抗Ⅹa因子活性评估肝素衍生物抗凝活性，测定结果基本一致。结论相比较肝素，这些化学修饰的肝素衍生物有较低的抗凝血活性，为安全应用这些肝素衍生物提供了更加广阔的前景。

抗凝血活性；肝素衍生物；活化部分凝血活酶时间；抗Ⅹa因子活性

研究表明生物高分子具有良好的生物相容性和降解性，广泛于应用医药领域。由于生物高分子在肿瘤组织中有渗透、滞留效应(EPR)[1]，生物高分子可与抗癌药物结合，制备成新的药物输送系统，使药物的溶解性得到改善、能够适当控制原药的释放速度、延长其体内循环时间，同时可增强药物稳定性等，这种生物大高子为与药物结合的输送系统，已成为肿瘤研究的热点之一，有广阔的应用前景[2,3]。

肝素（heparin）是一种天然糖胺聚糖，在动物组织和器官中广泛存在，并有好的水溶性、生物相容性和降解性，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能[4]。目前许多研究者开展了以肝素衍生物作为载体抗癌药物输送系统的工作，取得了很好的工作进展。然而肝素最重要的生物学特征是抗凝作用，作为应用最广的抗凝血剂，它能够破坏，抑制凝血酶的形成并阻止血小板聚集，但是用量过大，患者可能出现出血迹象，如血尿、咯血、消化道出血或颅内出血等现象。因此以肝素衍生物为药物载体，应同时对其抗凝活性进行检测，保证载体的安全应用。研究表明化学修饰能够适当降低肝素的抗凝血活性，且肝素衍生物还能保持其他的生物活性[5]，因此开展肝素衍生物的抗凝血活性评价，仍然十分必要。

目前实验室和临床上常用活化部分凝血活酶时间（APTT）和抗凝血因子Ⅹa活性的测定作为抗凝性能评价的重要指标，因此本文以一系列化学修饰的肝素衍生物为对象，通过测定它们的活化部分凝血酶时间（APTT）和抗Ⅹa因子活性，评估这些肝素衍生物的抗凝血活性，为进一步深入研究工作提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

肝素钠（Mw=15000Da，效价150 U/mg，伯奥生物科技公司，上海）；O-乙酰化肝素，O-丁酰化肝素和O-丁二酰化肝素（自制）；一次性真空采血管（BD Vacutainer）；APTT试剂盒（APTT试剂：脑磷脂、鞣花酸、防腐剂、稳定剂；0.025mol/L CaCl2；太阳生物技术公司，上海）；抗Ⅹa试剂盒（Coatest，瑞典）；正常人混合血浆由湘雅附三医院提供。PRECIL C2000型凝血仪（普利生仪器公司，北京）；DNM-9602酶标仪（普朗医药仪器公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 活化部分凝血酶时间（APTT）的测定

一次性凝血常规采血管：采血管中抗凝剂是枸椽酸钠（0.109M，0.3mL），真空控制抽血，血液与抗凝剂的比例为9∶1。正常人混合血浆的制备：一次性真空采血管取正常人静脉血，摇匀后离心10min（3000rpm），收集上层黄色血浆。APTT的测定：用蒸馏水配肝素标准品浓度分别为0.15、0.3、0.45、0.6、0.75U/mL。用蒸馏水配待测样为3μg/mL。将25μL肝素标品溶液或待测样溶液加入到0.1mL血浆中，摇匀后，加入100μL的APTT试剂。混合液在37℃下孵育2 min后，加入100μL预热的CaCl2溶液。凝血仪自动记录凝固时间。

1.2.2 抗Ⅹa因子的测定

取7.1nkat/mL的Ⅹa因子0.1mL，37℃保温3 min后，加入0.2mL的0.1unit/mL抗凝血酶ATⅢ，用PBS(0.05mM，pH 8.4)配25μL的不同浓度肝素和肝素衍生物，然后加入0.1mL的1mmol/L底物S-2222，37℃孵育2 min，加入300μL的20%乙酸，终止反应。测定肝素和肝素衍生物的吸光度（405nm）。制定肝素吸光度-浓度标准曲线，根据肝素衍生物的吸光度，计算出相对活性。

1.2.3 统计分析

采用SPSS10.0统计软件（美国SPPS公司）进行单向方差分析或t检验，实验数据以均数±标准差(χ—±s)表示。

2 结 果

血液凝固是一系列凝血因子的酶促反应。在凝血过程中，通过内源性凝血途径或外源性凝血途径可使血液凝血活酶形成。APTT是内源凝血因子缺乏最可靠的筛选试验，测定方法灵敏而且简便，因此可以被用来替代普通试管法凝血时间测定或者血浆复钙时间的测定，正常的APTT一般在28～44s之间。由于APTT对血浆中的肝素、类肝素浓度较为灵敏，是使用较为广泛的实验室监护指标。在本研究中我们应用活化部分凝血活酶时间（APTT）对化学修饰的肝素衍生物抗凝性质进行测定。

凝血因子是指对血浆及组织中直接参与的凝血物质。其中的一种在凝血过程中起着重要作用的糖蛋白-凝血因子Ⅹa（FⅩa）可以在凝血因子V、Ca2+、磷脂的辅助下，把凝血酶原活化为凝血酶。由于Ⅹa处于外源性和内源性激活途径的共同通路中心位置，因此Ⅹa生成后的凝血过程是两条凝血路径共有的，故Ⅹa因子抑制剂一方面能阻断内源性凝血，另一方面也能抑制外源性凝血的发生。因此，检测抗Ⅹa因子的活性是另外一个评价抗凝性能的指标。

通过测定肝素的APTT，回归肝素浓度-APTT的标准方程：y=32.06+18.13333x，相关系数r=0.976，通过标准方程计算出相应的肝素衍生物的相对抗凝活性。应用酶标仪测定肝素抗Ⅹa因子活性在405nm的吸光度-浓度标准方程：y=0.2907-0.338x，相关系数r=-0.9866，将肝素衍生物在405nm吸光值对应标准方程，计算出相对抗凝活性，测定结果见表1。

表1 肝素衍生物抗凝血活性(χ—±s)

表1结果分析，以肝素作为标准对照，应用APTT和抗Ⅹa因子法检测结果表明，合成的肝素衍生物的抗凝活性较肝素有所下降，说明酰化反应对肝素修饰后，部分降低了其抗凝活性，随着引入有机基团的分子量的增大，肝素衍生物的抗凝活性均呈下降的趋势，但都保持了一定的抗凝活性，应用抗Ⅹa因子活性与应用APTT测定结果一致。

3 结 论

我们应用两种抗凝血活性测试方法对肝素衍生物的抗凝效果进行评价，研究表明两种测试方法对抗凝效果评价基本一致，即化学修饰能够适当降低肝素衍生物的抗凝血活性，随着引入的有机基团的增多，肝素衍生物的抗凝血活性逐渐下降，但仍然保持一定的生物活性，对安全应用肝素衍生物为载体的药物输送系统的研究提供了更加广阔的前景。

[1] Seymour LW,Ulbrich K,Steyger PS,et al.Tumour tropism and anticancer efficacy of polymer-based doxorubicin prodrugs in the treatment of subcutaneous murine B16F10 melanoma[J].Br J Cancer,1994,70(4):636-641.

[2] Luo Y,Ziebell MR,Prestwich GD.A hyaluronic acid-taxol antitumor bioconjugate targeted to cancer cells[J].Biomacromoleclues,2000, 1(2): 208-218.

[3] 肖延龄,李伯.载药纳米微粒的临床应用研究进展[J].国外医学生物医学工程分册,2002,25(4): 174-179.

[4] Casu B,Guerrini M,Guglieri S,et al.Undersulfated and glycolsplit heparins endowed with antiangiogenic activity[J].J Med Chem,2004,47(4): 838-848.

[5] Sang KK,Bagalkot V,Eunhye L,et al.Oral delivery of chemical conjugates of heparin and deoxycholic acid in aqueous formulation [J].Thrombosis Research,2006,117(4): 419-427.

R917

B

1671-8194（2013）17-0081-02

国家自然科学基金（21204036）

*通讯作者