马立克氏病病毒RB1B株UL14蛋白原核表达及多抗血清制备

徐文财，刘 秋，秦爱建,，胡序明,，吴庚华，孙 苹，钱琨,，邵红霞,，金文杰,

（1.扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室，扬州 225009；2.扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室，扬州 225009）

马立克氏病病毒（Marek's disease virus, MDV）是一种致肿瘤性疱疹病毒，能够引起皮肤和内脏肿瘤，侵害中枢神经系统，导致易感鸡的瘫痪或死亡[1,2]。UL14蛋白是MDV编码的一种被膜蛋白，而被膜是MDV病毒粒子的重要组成部分。在1型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus 1，HSV1)中，UL14不仅具有抗凋亡作用[3]，还具有热休克蛋白（Host shock protein，HSP）功能并可以调节病毒的复制[4,5]。通过氨基酸序列分析发现，MDV UL14蛋白与HSV UL14蛋白同源，推测MDV的UL14也可能在病毒复制和转化中扮演着关键角色。通过基因芯片技术研究发现感染RB1B 毒株21 d后的SPF鸡胸腺组织中，UL14高水平表达[6]，这种表达的意义和作用是什么还不清楚。目前在MDV感染中还没有UL14功能的相关报道。为了弄清UL14在MDV感染中所起的作用，特别是UL14对MDV致瘤性是否有影响，本研究对UL14进行原核表达并制备特异性多抗，为以后UL14功能研究提供生物材料。

1 材料与方法

1.1 病毒 菌株与细胞RB1B超强毒株、E.coliDH5α、BL21（DE3）工程菌由扬州大学教育部禽类预防医学重点实验室保存，CEF细胞按实验室常规方法制备。

1.2 载体与主要试剂原核表达载体pGET32a购自Clontech公司；pGEM-T easy载体、T4连接酶购于美国Promega公司；凝胶回收DNA试剂盒购于德国AXYGEN公司；限制性核酸内切酶EcoR I、XhoI购自Fermentas公司；碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠IgG、IPTG、胰蛋白酶均购自Sigma公司。

1.3 引物设计与合成根据RB1B株UL14基因序列（GI：148806278）设计引物。为了便于目的基因的克隆，在上游引物中加入EcoR I 酶切位点，下游引物中加入XhoI 酶切位点。上游引物序列为5'-CCGAATTCATGTTTGCAGTGAGCGC-3'，下游引物为5'-TTCTCGAGTCATACACAGCTGTCTGA GA-3'，划线部分为引入的酶切位点。

1.4 UL14基因的扩增与克隆参照文献[7]报道的方法，从感染RB1B的CEF细胞中提取病毒DNA基因组。UL14基因的 PCR 扩增条件:95℃ 5 min；94℃ 1 min ，55℃ 1 min，72℃ 2 min，30 个循环；72℃ 10 min。PCR产物经凝胶回收后连入pGEM-T载体，并送上海英骏生物技术公司（Invitrogen）测序。

1.5 原核表达载体的构建将测序正确的pGEM-T-UL14重组质粒与 pET32a质粒 DNA 经EcoR I和XhoI双酶切，酶切产物电泳，回收相应的UL14片段与pET32a空载体片段，然后进行连接、转化，次日挑取单菌落制备质粒DNA，然后再利用EcoR I和XhoI双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳筛选正确插入目的基因的重组质粒。

1.6 UL14蛋白的原核表达将含有pET32a-UL14重组质粒的细菌接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 200 rpm 震荡培养 12 h，然后以 1：100 转接种到含有氨苄青霉素的2YT培养基中培养3 h，再加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，28℃ 180 rpm 震荡培养培养5 h，同时设未诱导的重组质粒转化菌作为对照。取出培养物，超声波裂解后，经12%SDSPAGE电泳分析鉴定，并用His亲和层析柱纯化。

1.7 鼠抗融合蛋白UL14多抗血清的制备将4只BALB/c小鼠分别腹腔注射纯化的融合蛋白，免疫剂量为每只100 μg蛋白，首次免疫后，每隔2 w以相同的方法和剂量进行加强免疫。小鼠4免10 d后分别采血分离血清。

1.8 Western blot鉴定参照文献[8]报道的方法。转印后用5%脱脂乳4℃封闭过夜。分别用抗UL14小鼠多抗血清和His单抗稀释后作为一抗，37℃作用1 h。然后用AP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，37℃作用1 h。用NBT避光显色20 min，最后用ddH2O终止反应。

1.9 IFA鉴定鼠抗融合蛋白UL14多抗血清的反应性用96孔细胞板培养RB1B感染的CEF细胞，约5～6 d后进行免疫荧光试验。分别用抗UL14小鼠多抗血清和ICR小鼠血清作为一抗，37℃作用1 h。然后用FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗，37℃作用1 h。最后每孔加50%甘油100 uL，并在荧光显微镜下观察结果。

2 结果

2.1 重组质粒pGEM-T-UL14与pET32a-UL14的鉴定PCR扩增目的基因，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果扩增出条带大小为732 bp的片段。经连接、转化后，挑取白色菌落扩大培养，用碱裂解法提取质粒DNA，用EcoR I和XhoI双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果获得了载体（2900 bp）和目的基因（732 bp）两个片段，与预期结果相符。将胶回收的UL14基因片段与pET32a空载体片段转化后得到pET32a-UL14重组质粒，并用EcoR I和XhoI双酶切重组质粒，经电泳后结果可见清晰的750 bp左右和5900 bp左右两条带，即获得了正确插入目的基因的重组质粒，且目的基因测序结果正确。

2.2 His-UL14融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析将重组质粒pET32a-UL14转化的BL21（DE3)大肠杆菌，经培养和诱导表达，菌体裂解物上清在分子量55 kDa处出现高表达条带，与His-UL14融合蛋白分子量一致（图1A)，而未诱导组无此条带（图1B）。用His亲和层析柱纯化表达的融合蛋白，然后分别用抗His标签的单抗和抗UL14多抗血清进行Western blot检测，结果显示，抗His标签单抗能特异性地识别出55 kDa的蛋白条带（图2A），并且多抗血清也能特异性地识别出55 kDa的蛋白条带（图2B）。

图1 UL14蛋白的SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE graph of recombinant UL14

图2 表达产物的Western blot分析Fig.2 Recombinant UL14 protein identifi ed by Western blot

2.3 免疫荧光分析用 RB1B 感染 CEF 细胞 5～6 d，然后以抗UL14多抗血清作1：200稀释后进行间接免疫荧光试验，结果在感染MDV的细胞中出现特异性荧光（图3A），而对照正常细胞则没有出现特异性荧光（图3B），结果证实用此融合蛋白免疫BALB/c小鼠后获得的多抗血清能与MDV RB1B感染的CEF细胞发生特异性反应。

图3 RB1B感染CEF细胞后的免疫荧光分析Fig.3 Immunofl uorescence analysis of CEF cells infected with MDV strain RBIB

3 讨论

UL14蛋白在人单纯疱疹病毒方面研究较多，而在MDV方面则没有相关报道。本研究对MDV UL14蛋白进行了原核表达，并成功制备了抗UL14多抗血清，该抗血清与MDV天然的UL14有良好反应性，研究结果对进一步研究MDV致病机理提供了可靠的生物材料。

被膜蛋白是MDV病毒粒子的重要组成。通过对被膜蛋白功能及其相互作用关系的了解，可以使我们更好地了解MDV装配途径，并为寻找新的抗病毒靶序列标提供了思路[9]。UL14蛋白是疱疹病毒编码的一种被膜蛋白。MDV UL14蛋白与HSV UL14蛋白同源。HSV UL14蛋白能够集中衣壳蛋白VP26和组装蛋白UL33进入到细胞核内[10]。在感染细胞中，尤其在感染的后期，UL14蛋白对HSV的复制起到非常重要的作用[4]，因此，MDV UL14蛋白在MDV致病过程中也可能扮演着重要作用。通过Real-Time PCR检测发现，在MDV感染后d 7、d 14、d 21、d 28 胸腺组织中，Meq 与 UL14 的表达趋势是一致的[6]，二者之间是否存在相互作用协同致肿瘤有待进一步试验证实。

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