上海市闵行区猪场中大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及生物学特性研究

赵秋华，王少辉，刘萍萍，姚建楠，李颖利，李蓓蓓，邵东华，史子学，魏建超，马志永

（1.上海市闵行区动物疫病预防控制中心，上海 201109；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）感染可引起出血性肠炎（hemorrhagic colitis，HC）、溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）、 血 小 板 减少 性 紫 癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP），其中，HUS和TTP的病情严重，病死率高。EHEC引起人类致病的最常见血清型为 O157：H7，该病原菌严重威胁人类健康，已成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题[1,2]。1982年，该病首次在美国爆发流行，随后在加拿大、英国、意大利、日本、爱尔兰、比利时、德国、澳大利亚、阿根廷、南非、以色列等国家爆发和流行[3-6]。我国1986年首次报告大肠杆菌O157：H7感染的病例，主要在江苏省、山东省、河南省、安徽省、广西省、福建省等十几个省市发生大肠杆菌O157：H7感染的散发病例[7]。

大肠杆菌O157：H7作为一种人兽共患病原菌，可以在畜禽中流行和传播，并通过动物源性食品传染给人。调查和监测结果表明，牛、羊、猪等家畜是大肠杆菌O157：H7的天然宿主，且牛和猪是大肠杆菌O157：H7的主要宿主，阳性率高于其他动物[8]。虽然猪是大肠杆菌O157：H7的宿主，但该菌引起猪发病并不多见，多为阴性感染，但可向环境中排毒，具有潜在的食品安全隐患[9]。对上海地区猪场中大肠杆菌O157：H7进行流行病学调查，了解其毒力因子和耐药情况，有助于控制大肠杆菌O157：H7在猪场中的流行和传播，防止其经动物源性食品在人间传播。因此，本研究对采集上海地区某3个猪场猪280份样品进行大肠杆菌O157：H7分离鉴定和生物学特性研究，将对预防和控制大肠杆菌O157：H7在猪场中的流行和传播具有重要的兽医公共卫生意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 营养肉汤（NB）为上海科技公司产品；大肠杆菌O157显色培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；大肠杆菌O157和H7诊断血清为宁波天润生物药业有限公司产品；细菌微量发酵管、药敏试纸均购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×TaqPCR Master Mix 购自天根生化科技有限公司；Veriti 96 Well Thermal Cycler PCR 扩增仪购自Applied Biosystem公司；DYY-GC型电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪购自Bio-Rad公司。

1.1.2 病料 2012年4～12月份分别采集上海市某三个猪场的猪粪便样品和肛拭子样品共280份。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 将粪便样品和肛拭子样品混于 500 μL NB 培养基中，37℃培养增菌 6～8 h，划线接种于O157显色培养基上，37℃培养16～20 h，挑取疑似单菌落划线在平板上划线纯化，挑取疑似单菌落接种于LB培养基中，37℃培养6～8 h，进行下一步鉴定。

1.2.2 血清学鉴定 分别应用O157和H7单因子诊断血清与待检细菌在玻片上进行凝集反应，测定细菌的血清型。凝集试验以生理盐水作为阴性对照，以大肠杆菌O157：H7标准菌株ATCC35150作为阳性对照。

1.2.3 PCR鉴定 根据O157抗原和H7抗原编码基因（rfbE和fliC）进行双重PCR鉴定大肠杆菌O157：H7[10,11]。移取 1 mL 增菌液至灭菌 EP 管中，10 000×g离心 5 min，弃上清，然后加入 100 μL灭菌去离子水重悬沉淀，于沸水中加热10～15 min，再次10 000×g离心5 min，收集上清液，作为PCR反应模板。PCR 反应体系如下:2×PCR Master Mix 12.5 μL，引物O157-F、O157-R、H7-F、H7-R（表1）各取0.8 μL，模板（粗提DNA）2.0 μL，最后加灭菌ddH20至25 μL。同时设立阳性对照，阴性对照。PCR反应条件如下:95℃预变性5 min；95℃变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 40 s，35 个循环；72℃ 延伸10 min。1.0%琼脂糖凝胶上电泳各样品5 μL，紫外灯下拍照，记录PCR结果。

1.2.4 生化试验 将细菌分别接种于肠杆菌微量生化管中，37℃倒置培养24 h，观察并记录结果，确定菌株的各项生化特性。

1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散法进行药敏试验。将所保存的纯化菌株分别在37℃营养肉汤中培养18～24 h，致密划线于琼脂平板表面，用无菌镊子将药敏片贴于培养基表面，37℃培养24 h后测抑菌圈直径，根据美国临床检验标准委员（CLSI）标准判定大肠杆菌O157：H7对药敏纸片的敏感性（表2）。

表1 大肠杆菌O157: H7特异性基因检测引物Table 1 Primers for detection of E.coli O157:H7

表2 药物敏感性判断标准Table 2 Primers for detection of E.coli O157:H7

1.2.6 毒力基因检测 根据大肠杆菌O157毒力基因序列分别设计并合成引物（表 1），采用PCR检测这些毒力基因在大肠杆菌中的分布。PCR反应体系:2×PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F、R 各取1.0 μL，模板（粗提 DNA）2.0 μL，最后加灭菌ddH2O至25 μL。PCR反应参数:95℃5 min；95℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30～50s，30 个循环；72℃10 min。1.0% 琼脂糖凝胶上电泳各样品 5 μL，紫外灯下拍照，记录PCR结果。

2 结果

2.1 细菌的分离培养大肠杆菌 O157：H7 在 O157 选择性培养基上呈红色、淡红色或红色菌落，菌落周围没有蓝色晕圈，其他大肠杆菌显暗蓝色、蓝色或紫色，菌落周围有蓝色晕圈；而其他细菌显蓝色、黄色或无色。280个样品经过O157选择性培养基筛选，挑取17个疑似单菌落。

2.2 大肠杆菌O157:H7的PCR鉴定采用PCR方法检测17株疑似菌株是否为大肠杆菌O157：H7，以ATCC35150菌株为阳性对照。结果表明来自于15和17号疑似菌株出现特异性条带（图1），表明该菌株为大肠杆菌O157：H7，分别命名为EHEC01和EHEC02。在检测的280个样品中，有2份细菌经PCR鉴定为大肠杆菌O157：H7，样本细菌分离率为0.71%。

图1 大肠杆菌O157:H7 PCR检测结果Fig.1 The PCR detection of E.coli O157:H7

2.2 血清学鉴定结果对PCR呈阳性的菌株进行血清学鉴定，分别将其与O157和H7诊断血清做玻片凝集试验，结果表明该菌株与O157和H7诊断血清均出现凝集现象，而与阴性对照血清和生理盐水则均无凝集现象。凝集试验结果表明分离所得的2株细菌为大肠杆菌O157：H7，与PCR结果一致。

2.3 生化试验结果将大肠杆菌O157：H7菌株分别接种于微量生化管，培养后观察。结果表明，该细菌能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇；发酵蔗糖，产酸不产气；M-R试验、吲哚试验阳性；VP试验、柠檬酸盐利用试验阴性；不产生硫化氢（H2S）。以上生化结果与大肠杆菌O157：H7的生化特性相符合。

2.4 药敏试验结果选用β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、氯霉素类抗生素、大环内酯类抗生素、多肽类抗生素、氟喹诺酮类药物和利福霉素类抗菌药共24种抗菌药物对分离得到的大肠杆菌O157：H7进行药敏试验，药敏结果见表3。药敏结果表明大肠杆菌O157：H7的耐药性程度都较高，两者对24种药物的耐药性均为62.5%。而敏感药物仅有头孢西丁（美褔仙）、头孢他啶（复达欣）和丁胺卡那霉素3种。

2.5 毒力因子分布采用PCR方法对大肠杆菌O157：H7分离株的主要毒力基因（stx1、stx2和eae）进行检测，结果显示两株大肠杆菌O157：H7均含有eae基因。EHEC01分离株含有stx1基因，提示其只携带1型志贺毒素；而EHEC02分离株不携带志贺毒素基因（图2）。

表3 大肠杆菌O157:H7的药敏试验结果Table 3 Results of antibiotic sensitivity test of E.coli O157:H7

3 讨论

近年来，由EHEC引起的食源性疾病在世界范围内许多国家都时有报道，如最近发生在德国由豆苗污染引起的EHECO104：H4暴发事件，导致2000多人感染，约数十人死亡，这次疫情对整个欧洲都造成了一定的影响[12]。EHEC主要包括O157：H7、O26：H11和 O111等血清型，其中 O157：H7是最重要的一种血清型。研究表明，家畜家禽是大肠杆菌O157：H7的主要动物宿主和传染源，其中最主要的宿主为牛，其次为羊、猪、禽类[8]。因此，本文对上海地区猪场中大肠杆菌O157：H7的分布及生物学特性进行研究，有助于控制大肠杆菌O157：H7在畜禽中的流行和传播，防止其经动物源性食品传染给人。

图2 毒力基因检测结果Fig.2 The results of PCR for detection of virulence genes

本文采用增菌、选择性培养基筛选、PCR鉴定的方法分析大肠杆菌O157：H7在280份猪场样品中的分布。结果从不同猪场的2份断奶腹泻仔猪的粪便样本中分离鉴定出大肠杆菌O157：H7，分离率为 0.71%（2/280）。Yan等[13]对 2005-2006年 上海奉贤区不同猪场的粪便样品中大肠杆菌O157进行流行病学调查，结果表明1.1%的样品含有大肠杆菌O157，其于分离率高的原因在于仅检测大肠杆菌 O157（包括 O157：H7 和 O157：NM）。王建等[14]检测2003-2004年上海地区动物及其产品中大肠杆菌O157：H7带菌情况，结果表明5.71%的猪粪便样品携带大肠杆菌O157：H7。顾宝柯等[15]的检测结果表明，2000-2001年上海地区猪粪便中大肠杆菌O157：H7的检出率为3.4%，其中2000年和2001年的检出率分别为1.4%和5.67%。杨丽华等[16]检测了上海市闵行区家禽畜大肠杆菌O157：H7带菌状况，猪粪中大肠杆菌O157：H7的阳性率高达9.76%。造成大肠杆菌O157：H7不同的检出率的原因可能为不同时间、不同猪场、不同采样方法。

志贺毒素（Stx1、Stx2）和紧密素（Intimin）是EHECO157的主要致病因子，其分别由stx1、stx2和eae基因编码，是判断EHEC O157菌株致病力强弱的重要因素[17]。自然界中存在的大肠杆菌O157有的产毒，而有的不产毒，它们对人的致病性有很大差异，但是表型几乎相同，用传统的血清学方法也难以分辨，本文采用简便、快速、特异的PCR方法检测分离菌株所携带的主要毒力基因进行检测，更加清楚的了解了每个菌株的毒力特性。志贺毒素是EHEC重要的毒力因子之一，具有细胞毒性、肠毒性和神经毒性，是导致感染者死亡或出现重型病症的主要原因。目前认为EHECO157：H7之所以能对人类引起如此大的危害，其主要都是志贺毒素的作用[17]。本次分离鉴定的EHECO157：H7菌株均不携带Stx2，而仅EHEC01含有Stx1，这与相关报道中的结果相比稍低[18]，其原因可能由于不同来源的菌株具有不同的特性。LEE毒力岛上的重要毒力基因eae编码的紧密素是导致肠道出现典型粘附与消除损伤的主要致病因子，本次分离的两个菌株都含有eae基因，这一结果与“eae基因在EHEC菌株中广泛存在”的说法[18]是一致的。

本研究对分离的EHECO157：H7进行体外药敏试验，结果表明2株EHECO157：H7均具有很强的多重耐药性，仅对头孢西丁（美褔仙）、头孢他啶（复达欣）和丁胺卡那霉素3种药物敏感。滥用抗生素可导致细菌产生耐药性，给养猪业的疾病控制带来了极大的危害，并有可能通过食物链将耐药性基因传递给人类。由于EHEC致病机理的特殊性，滥用抗生素不仅难以控制病情，还会促进志贺毒素的释放，使其在体内发挥作用，增加了疾病的控制难度。因此，使用抗生素控制病情时，要在科学分析的基础上，选用合适的防控方法。

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