SHIP和Caspase－3mRNA在骨髓增生异常综合征患者骨髓组织中的表达及其临床意义

贾晓辉，罗建民，刘亚平，尹婉宜，张丽红

（1.河北医科大学第一医院血液内科，河北 石家庄 050031；2.河北医科大学第二医院血液内科，河北 石家庄 050000）

SHIP和Caspase－3mRNA在骨髓增生异常综合征患者骨髓组织中的表达及其临床意义

贾晓辉1，罗建民2，刘亚平1，尹婉宜1，张丽红1

（1.河北医科大学第一医院血液内科，河北 石家庄 050031；2.河北医科大学第二医院血液内科，河北 石家庄 050000）

目的：检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓组织中SHIP、Caspase－3mRNA的表达，探讨其表达与MDS发病及向白血病转化过程的关系。方法：根据国际预后评分系统（IPSS）选择62例MDS患者，其中低危（low－risk）组20例、中危1（Int－1）组12例、中危2（Int－2）组13例和高危（high－risk）组17例，采用 RT－PCR法检测62例MDS患者及30例健康正常者（对照组）骨髓单个核细胞（BMNC）中SHIP mRNA及Caspase－3mRNA的表达水平，并分析两者之间的关系。结果：MDS低危组和中危1组BMNC中SHIP mRNA表达率（100%，100%）及表达水平（4.467±2.899，4.529±1.975）分别与对照组（100%，4.623±2.979）比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；在中危2组和高危组中，BMNC中SHIP表达率（92%，88%）下降，表达水平（2.124±1.880，2.574±1.807）低于对照组（P＜0.05）。Pearson相关分析，MDS患者 BMNC中SHIP mRNA 与 Caspase－3 mRNA表达水平呈正相关关系（r＝0.714，P＜0.05）。随骨髓原始细胞比例升高，SHIP mRNA表达水平降低（F＝3.7，P＜0.05），不同性别（t＝0.940，P＞0.05）、不同年龄（t＝1.419，P＞0.05）患者SHIP mRNA表达水平差异无统计学意义。结论：SHIP在高危MDS患者BMNC中呈低表达或不表达，其表达水平可以作为判定MDS预后的一个指标。

骨髓增生异常综合征；基因表达；SHIP；聚合酶链反应

含SH2结构域的肌醇磷酸酶（SH2domaincontaining inositol 5′－phosphatase，SHIP）蛋白是肌醇5′磷酸酯酶家族中的重要一员，位于人类染色体2q36－q37.1。目前研究［1－2］表明：SHIP 基因在造血细胞的发生发展和功能方面起关键的负调控作用，在抑制白血病的发生发展过程中起重要作用。骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）为一组异质性疾病，高风险向急性白血病转化是其特征，其发病、疾病进展机制尚不完全明确。目前有关SHIP基因与MDS疾病进展机制研究国内外尚无相关报道。本研究采用RTPCR法检测各组MDS患者骨髓单个核细胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）SHIP和半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶－3（Caspase－3）mRNA表达水平，探讨其在MDS患者骨髓中的表达及其与MDS发病及向白血病转化的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2009年9月—2012年10月河北医科大学第一医院血液内科收治的MDS患者［3］62例，其中男性32例，女性30例，中位年龄62岁；根据国际预后评分系统（IPSS）积分分组和评价预后，其中低危（low－risk）组20例，中危1（Int－1）组12例，中危2（Int－2）组13例，高危（highrisk）组17例。对照组为30例健康志愿者，其中男性17例，女性13例，中位年龄为31岁。

1.2 治疗方法 低危组、中危1组患者给予粒细胞集落刺激因子（G－CSF）、促红细胞生成素（EPO）、十一酸睾酮、沙利度胺、全反式维甲酸和成分输血等治疗。中危－2组及高危组患者给予标准或减量的柔红霉素、阿糖胞苷（DA方案），阿克拉霉素、阿糖胞苷和G－CSF（CAG方案）等化疗方案及支持治疗。

1.3 检测方法 治疗前的MDS患者和健康对照者均采集新鲜骨髓液4mL，用淋巴细胞分离液提取BMNC备用。提取细胞总RNA，用随机六聚引物合成cDNA：在20μL反应体积中加入1μg总RNA，37℃、60min反转录，95℃、5min终止反应。PCR 反应体积25μL，含cDNA、MgCl2、4种dNTPs、引物和 Taq酶。引物由美国Cybersyn公司合成。GAPDH扩增条件：94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，22个循环，最后72℃延伸10min；SHIP扩增条件：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min；Caspase－3扩增条件：94℃变性40s，68℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸10min。在每个扩增循环结束后，100℃、10min灭活Taq酶。产物分析：取10μL扩增产物，10g·L－1琼脂糖凝胶电泳（90V、40min），溴化乙锭染色，紫外透射仪观察结果并拍照，采用凝胶图像分析术进行扫描并定量，结果以SHIP、Caspase－3mRNA与GAPDH mRNA光密度比值表示。

1.4 目的引物的合成 以GAPDH为内参照基因，引物由美国Cybersyn公司合成。见表l。

表1 RT－PCR引物序列Tab.1 The sequences of RT－PCR primers

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。SHIP、Caspase－3表达率组间比较采用χ2检验；SHIP、Caspase－3表达水平组间比较采用单因素方差分析。在MDS患者中SHIP mRNA与 Caspase－3mRNA 相关性分析采用Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1 各组患者BMNC中SHIP mRNA表达率和表达水平 SHIP mRNA表达率：低危组20例患者均呈阳性表达，表达率为100%；中危－1组12例患者均呈阳性表达，表达率为100%；中危－2组13例中12例呈阳性表达，表达率为92%；高危组17例患者中15例呈阳性表达，表达率为88%；对照组30例患者均呈阳性表达，表达率为100%。MDS各组分别与对照组比较，SHIP mRNA表达率差异均无统计学意义（χ2＝6.796，P＞0.05）；SHIP mRNA表达水平：低危组为4.467±2.899，中危1组为4.529±1.975，中危2组为2.124±1.880，高 危 组 为 2.574±1.807，对 照 组 为4.623±2.979。低危、中危1组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），中危2组和高危组低于对照组（P＜0.05），见表2。各组 SHIP基因（238bp）及 GAPDH 基因 （358bp）特定片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1～5。

图1 对照组SHIP基因表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in control group

2.2 各组患者BMNC中Caspase－3mRNA表达率和表达水平 Caspase－3mRNA表达率：5组患者Caspase－3mRNA表达率均为100%，组间比较差异无统计学意义 （P＞0.05）；Caspase－3mRNA表达水平：低危组为1.954±0.972，中危1组为2.068±0.983，中危2组为1.254±0.756，高危组为1.206±0.685，对照组为2.041±1.118。低危、中危1组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），中危2组、高危组低于对照组 （P＜0.05）。见表3。

图2 低危组SHIP基因表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in low－risk group

图3 中危1组SHIP基因表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in Int－1group

图4 中危2组SHIP基因表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in Int－2group

图5 高危组SHIP基因表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expression of SHIP mRNA in high－rish group

2.3 SHIP mRNA 与 Caspase－3mRNA 表达水平的相关性分析 MDS患者中SHIP mRNA与Caspase－3mRNA表达水平呈正相关关系 （r＝0.714，P＜0.05）。

2.4 SHIP mRNA表达水平与MDS患者临床参数的关系 MDS患者随骨髓原始细胞比例升高SHIP mRNA 表达水平降低 （F＝3.700，P＜0.05），不同性别、不同年龄患者SHIP mRNA表达水平比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。见表4。

表2 各组SHIP mRNA的表达水平Tab.2 The expression levels of SHIP mRNA in various groups

表3 各组Caspase－3mRNA的表达水平Tab.3 The expression levels of Caspase－3mRNA in various groups

表4 不同临床参数MDS患者SHIP mRNA表达水平比较Tab.4 Comparisons of the expression levels of SHIP mRNA in MDS patients with different clinical parameters

3 讨 论

MDS是克隆性的造血干／祖细胞疾病，其主要临床特征是无效造血、外周血细胞减少和高风险向急性白血病转化，尤其高危MDS患者治疗效果差、预后差，30%～50%MDS患者会转变为急性白血病，且以急性髓细胞白血病为主［4－6］。但是目前对MDS的发生发展机制尚不十分明确。

Luo等［2，7］于2003年发现了急性白血病患者存在SHIP基因功能结构域突变。SHIP广泛表达于造血细胞。SHIP通过调控造血祖细胞的存活与增殖，在抑制白血病的发生发展过程中起重要作用，SHIP的表达水平和（或）活性的降低，可能是髓系白血病克隆增殖的先决条件［8］。

本研究根据IPSS积分系统将MDS分为低危组、中危1组、中危2组、高危组，前2组患者预后相对较好，治疗以改善生活质量为治疗目的；后2组患者预后差，以延长存活时间为治疗目的。本研究结果显示：MDS患者BMNC中SHIP、Caspase－3mRNA在低危组、中危1组的表达水平与健康人群差异无统计学意义，而在中危2组、高危组的表达水平明显低于健康人群。SHIP、Caspase－3mRNA表达水平的下降，与IPSS评分上升相符，可以做为MDS的预后指标。Pearson相关性分析显示：SHIP mRNA 与 Caspase－3 mRNA在MDS中的表达水平呈正相关关系。在中危2组、高危组患者中，部分患者进展为白血病，可能与SHIP活性下降和（或）缺失、削弱了PI3K途径促进细胞凋亡的作用及导致了白血病细胞克隆的增殖有关。SHIP特异地清除PIP3，使下游分子信号AKT激活，AKT磷酸化水平增强，Akt／PKB可直接催化Caspase－3磷酸化使之失活，抑制Caspase促细胞凋亡的作用。Caspase－3促进慢性粒细胞白血病细胞凋亡，并在其中起着关键作用也已得到证实［9－11］。

SHIP mRNA表达水平与MDS患者的年龄、性别无明显关联性，但其与骨髓中原始细胞比例有关，SHIP mRNA表达水平高原始细胞组低于低原始细胞组。Lee等［12］研究表明：高危MDS患者常伴有SHIP－1蛋白表达水平下降。MDS和急性白血病具有相似的发病机制［13］，SHIP、Caspase－3 mRNA表达水平的下降，在白血病的发病机制中已得到证实［14－15］。SHIP mRNA 在 MDS患者骨髓组织中的表达水平下降，可能是MDS转化为白血病发病过程中的一个重要环节。

SHIP基因的活性下降和（或）缺失与白血病的发生发展、预后和治疗效果有密切关联。因此，密切观察SHIP和Caspase－3基因的表达水平，探讨其在MDS中可能发挥的作用及作用机制，既可以作为评估MDS进展及预后的指标，又可以提供预测MDS向白血病转化危险性的指标。

［1］Rohrschneider LR，Fuller JF， Wolf I，et al.Structure，function，and biology of SHIP proteins ［J］.Genes Dev，2000，14（5）：505－520.

［2］Luo JM，Yoshida H，Komura S，et al.Possible dominantnegative mutation of the SHIP gene in acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2003，17（1）：1－8.

［3］张之南，沈 悌.血液病诊断及疗效标准［M］.北京：科学出版社，2008：157－163.

［4］王淋淋，高 冲，陈宝安.MDS转化为AML机制的研究进展［J］.中国实验血液学杂志，2011，19（1）：254－259.

［5］Jian Y，Dunbar A，Gondek LP，et al.Aberrant DNA methylation is a dominant mechanism in MDS progression to AML［J］.Blood，2009，113（6）：1315－1325.

［6］廖荣霞，谌谐婉，詹小青，等.miRNA调控骨髓增生异常综合征的发生发展［J］.生命的化学，2012，32（1）：52－54.

［7］罗建民，刘泽林，郝洪岭，等.急性白血病细胞SHIP基因的突变分析 ［J］.中华血液学杂志，2004，25（7）：385－388.

［8］谭 博，张殿政，陈汉春.SHIP蛋白质的生物学特性及其与白血病的关系［J］.生命的化学，2011，31（2）：244－247.

［9］尚振川，宋霆婷，孙秉中，等.Caspase－3在慢性粒细胞白血病信号转导中的作用［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2009，23（1）：44－46.

［10］刘小军，杨 琳，温树鹏，等.SHIP基因突变对白血病细胞系K562细胞迁移及侵袭的影响［J］.中华血液学杂志，2012，33（1）：38－42.

［11］李晓花，薛天阳，许 伟，等.Caspase3在 MG－132诱导白血病L1210细胞凋亡过程中的作用［J］.中国小儿血液与肿瘤杂志，2010，15（3）：112－114.

［12］Lee DW，Futami M，Carroll M，et al.Loss of SHIP－1 protein expression in high－risk myelodysplastic syndromes is associated with miR－210and miR－155［J］.Oncogene，2012，31（37）：4085－4094.

［13］尹冬梅，许洪志，张婧瑶，等.AA、MDS和 AML患者CD4＋T细胞亚群的变化及其临床意义［J］.山东大学学报：医学版，2012，50（3）：66－70.

［14］Kedar R，Sabag O，Licthenstein M，et al.Soluble CD40 ligand（sCD40L）provides a new delivery system for targeted treatment：sCD40L－Caspase 3chimeric protein for treating B－cell malignancies［J］.Cancer，2012，118（24）：6089－6104.

［15］杨 琳，罗建民，刘小军，等.SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究［J］.中国生物工程杂志，2009，29（6）：14－19.

Expressions of SHIP and Caspase－3mRNA in bone marrow tissue of patients with myelodysplastic syndrome and their clinical significances

JIA Xiao－hui1，LUO Jian－min2，LIU Ya－ping1，YIN Wan－yi1，ZHANG LI－hong1
（1.Department of Hematology，First Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031，China；2.Department of Hematology，Second Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

Objective To detect the expressions of SHIP mRNA and Caspase－3mRNA in bone marrow tissue of the patients with myelodysplastic syndrome（MDS）and to discuss the relationship between SHIP mRNA and Caspase－3 mRNA expressions and the occurrence and development of MDS.Methods 20low－risk MDS cases（low－risk group），12Int－1MDS cases（Int－1group），13Int－2MDS cases（Int－2group），and 17high－risk MDS cases（highrisk group）were selected according to International Prognostic Scoring Syterm（IPSS）.30healthy volunteers were regared as control group.The expression levels of SHIP mRNA and Caspase－3mRNA in bone marrow mononuclear cells（BMNC）in various groups were detected by RT－PCR method，and the relationship between them was analyzed.Results The positive rates of SHIP mRNA were 100%and 100%and its expression levels were 4.467±2.899and 4.529±1.975in low－risk group and Int－1group，respectively，while they were 100%and 4.623±2.979in control group，so there were no significant differences between low－risk group，Int－1group and control group（P＞0.05）.The positive rates of SHIP mRNA were 90%and 88%and the expression levels were 2.124±1.880and 2.574±1.807in Int－2group and high－risk group，respectively，so there were significantly differences compared with control group （P＜0.05）.The Pearson correlation analysis results showed that the positive correlations were found between the level of SHIP mRNA and the level of Caspase－3mRNA in MDS patients（r＝0.714，P＞0.05）.The expression level of SHIP mRNA was decreased with the increasing of premitive cells（F＝3.7，P＜0.05）.There were no significant differences of SHIP mRNA expression levels of patients between different genders（t＝0.940，P＞0.05）and different ages（t＝1.417，P＞0.05）.Conclusion The expression level of SHIP is lower or the SHIP doesn’t express in BMNC of the high－risk MDS patients，and its expression level can be used as an indicator to judge the prognosis of MDS.

myelodysplastic syndrome；gene expression；SH2domain－containing inositol 5’－phosphatase；polymerase chain reactiom

R551.3

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0554－05

10.7694／jldxyxb20130327

2013－02－04

河北省自然科学基金资助课题 （H2012206139）

贾晓辉 （1970－），男，河北省武强县人，主治医师，医学硕士，主要从事恶性血液病的基础与临床研究。

罗建民 （Tel：0311－66003927，E－mail：luojm315＠yahoo.com.cn）