中国一进行性肌营养不良家系相关致病基因Dystrophin突变检测结果分析

田 莉，张 凌，杜 戎，朱元洲，柯琴梅，祝建芳

(华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉430022)

进行性肌营养不良(DMD)是一种致死性的常见肌肉遗传疾病。根据目前研究，DMD发病多与遗传因素有关［1］。在众多确定与DMD发病有关的致病基因中，抗肌萎缩蛋白基因(Dystrophin基因)备受关注。Dystrophin基因位于X染色体短臂(Xp 21.1-3)，是目前已知最长的人类基因。根据国外报道，其主要突变类型为基因部分缺失，占全部突变类型的60% ～65%［2～4］。本研究以Dystrophin基因为候选基因，对一个中国DMD家系成员进行了基因突变检测，以期了解Dystrophin基因突变情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 该DMD家系来自中国河南，其家系有1例确诊患者(先证者)，家系图见图1。此患者为15岁男性，近半年出现进行性肌无力，无既往特殊病史和家族史，其血清肌酸激酶明显增高。我们对此家系的所有成员进行临床调查，包括是否出现肌无力和肌萎缩、肌酶变化、家族史等，并作全面肌酶检测。阳性患者符合以下诊断标准:①以缓慢进行性的对称性肢体近端肌萎缩和肌无力为主症，呈翼状肩胛、鸭步、肌病面容或假性肥大等征象，但无肌肉压痛，Gower征阳性;②多在儿童和青少年期发病，常有家族遗传史;③尿肌酸增加，肌酐减少，血清肌酸磷酸激酶和乳酸脱氢酶等增高，血、尿肌红蛋白增高;④肌电图可见自发电活动增多，轻收缩时显示多相波明显增多，电位时限缩短，波幅降低，并有病理干扰相;⑤肌肉活检可见肌纤维肿胀或萎缩、变性，大量脂肪和结缔组织增生。在获得家系成员知情同意后，抽取外周静脉血5 mL，置于含有ACD抗凝管中备用。随机抽取140例家系外正常健康对照者，其中男64例，女76例，均无肌萎缩及肌无力表现，无肌酶改变，获得知情同意后，抽取外周静脉血5 mL，置于含有ACD的抗凝管中备用。

图1 DMD家系示意图

1.2 Dystrophin 基因检测

1.2.1 主要仪器及试剂 台式高速低温离心机;水平及垂直电泳仪系列;PCR仪;MF3-11多功能三维旋混仪;UVP Bio Spectrum R600Imaging System凝胶成像仪;Tag DNA聚合酶，dNTP等。

1.2.2 模板制备与PCR扩增 用快速盐析法提取外周血全基因组DNA，置－20℃冰箱备用。对Dystrophin基因79对引物分别进行扩增，其中第59号外显子引物为:上游 5'CAAAGGGAGTTATCTGTGAGG 3'，下游 5'GAATTTGTGAAAGACGGACTG 3'，片段长度749 bp，PCR后用于测序和限制性核酸内切酶处理。引物均由武汉擎科新业生物技术有限公司合成。引物PCR反应体系20μL，组份为:灭菌纯水6μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，DNA 模板(50～100 ng/μL)2 μL，2×Taq PCR Green Mix 10 μL。两对引物退火温度均为54.5℃，共36个循环。

1.2.3 DNA直接测序及限制性核酸内切酶分析(RELP) 由武汉擎科新业生物技术有限公司将所需测序样本PCR产物用双脱氧末端终止测序法行DNA序列测定。限制性核酸内切酶处理:内切酶Msp1，切点 TC CGG，20 μL体系中，内切酶(Msp1)0.5 ～2 μL(10 U/μL)、DNA(0.5 ～1 μg/μL)1 μL、10×Buffer Tango 2μL，37℃水浴过夜。处理后，用1.5%琼脂糖水平跑胶，凝胶成像系统照相并保存。

2 结果

2.1 DNA直接测序结果 先证者行Dystrophin基因所有外显子的测序。测序结果用Chromas软件进行BLAST分析，再将测序峰与网上检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)结果重新比对。先证者Dystrophin基因第9017位发生G→A的纯合突变(上下为正反向测序图)，在网上序列比对后得出，此为错义变异，其所代表的精氨酸的2937位密码子变化为谷氨酰胺(R2937Q)，见图2。

图2 DNA直接测序结果

2.2 RELP结果 先证者9017位位点发生纯和变异，故没有被酶切(Ⅳ1);家系内其他成员和正常对照者9017位位点未发生变异，故被酶切成两段(256 bp和493 bp)。

图3 先证者及其他家系成员、健康对照者基因变异位点PRLP结果

3 讨论

DMD是一种遗传性、进行性加重的肌肉疾病，其特征为进行性近端肌肉无力，伴肌纤维的破坏与再生，被结缔组织所取代［5］。DMD患者多预后不良，一般学龄期初诊［6］，多因呼吸衰竭或心脏衰竭等并发症而死亡。其遗传特征多符合X染色体隐性遗传，由于女性有两条X染色体，当隐性致病基因在杂合状态时，隐性基因控制的性状或遗传病不显示出来，此为女性表型正常的致病基因携带者，只有当两条X染色体上等位基因都是隐性致病基因纯合子时才表现出来。而男性只有一条X染色体，Y染色体上缺少同源节段，所以只要X染色体上有一个隐性致病基因就发病［7］。

鉴于DMD明显的遗传特征，国内外许多学者对此进行了研究。目前较为肯定的致病基因是Dystrophin基因，其包括79个外显子，全长约为2 500 kb。其mRNA序列长1.4 kb，主要表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织［7～12］。Dystrophy 基因按照功能划分可分为四部分:氨基端区域(1～8号外显子)、中央棒状区(9～62号外显子)、富含半胱氨酸区域(63～69号外显子)、羧基端区域(70～79号外显子)。之前已知的突变类型中最为常见的为基因缺失，存在2个缺失热区，一个位于中央区域，是最多见的缺失区域，多包括45～55号外显子，另一个缺失热区位于基因的5'端，多包括2～20号外显子。有报道称，缺失热区中外显子缺失断裂点的分布在亚洲及欧洲人群中存在差异［13～16］。

鉴于人种的差异，本研究检测了一个中国DMD家系Dystrophin基因突变类型。结果发现，先证者出现了一个碱基纯合错义变异，是位于第59号外显子(c.9017G＞A)，导致代表精氨酸的2937位密码子突变为谷氨酰胺(p.Arg 2937Gln)，而对其家系进行检测后，其遗传类型并不符合X染色体隐性遗传规律。目前该突变尚未在其他文献及DMD数据库中报道。进一步对正常对照者进行筛查，初步排除基因多态性的可能，因而推测此为一个碱基突变。由于此突变在此家系先证者中出现，故考虑此位点的碱基突变与家系DMD的致病可能有密切的关联。Dystrophy基因第59号外显子位于中央棒状区，其转录可能会影响Dp427蛋白，后者主要表达于脑、肌肉等组织中。推测Dystrophy基因第59号外显子中的错义突变可能会影响上述蛋白的结构或功能，从而导致一些临床症状的发生。

本研究在我国DMD家系先征者中发现了Dystrophin基因一个新的突变位点，说明我国DMD患者可能存在与国外不同的基因突变位点。其家系遗传可能并不符合X染色体隐性遗传规律，故目前应进一步进行家系研究，并对新发现的突变进行相关细胞生物学表达试验。

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