甲状腺癌复发与BRAF基因突变的关系探讨

金 纯，邹章勇，程 溥，刘 乐，郭贵龙

(温州医学院附属第一医院，浙江温州325000)

甲状腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，发病率居头颈部肿瘤之首。大部分甲状腺癌患者都能获得良好预后，但有一小部病例会出现术后复发，预后差［1］。为了解甲状腺癌复发与BRAF基因突变的关系，我们检测了2004年8月～2012年2月收治的20例复发甲状腺癌患者原发灶、复发灶及20例无复发甲状腺癌患者肿瘤组织中BRAF基因T1799A位点的V600E突变情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2004年8月～2012年2月收治的20例复发甲状腺乳头状癌患者，为复发组。其中男6例、女14例，平均年龄48.4岁(21～79岁)。取其原发癌组织和复发癌组织蜡块标本。另随机选取2004～2006年于我院接受手术、随访至2013年1月1日无复发生存的20例甲状腺乳头状癌患者为无复发组，亦取其肿瘤组织蜡块。所有病例均无术前治疗史，无头颈部肿瘤病史，无重大内科疾病史。1.2 BRAF基因T1799A位点突变检测 将上述蜡块送苏州生物医药公司纯化并用聚合酶链反应扩增后直接测序，所得结果与BRAF基因组DNA正常序列对比以确定有无点突变。

1.2.1 DNA的提取 将上述所取的蜡块标本碾碎，提取DNA，提取的DNA于－20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增目标片段 设计引物，引物由苏州生物医药公司合成，引物序列如下:正向引物5'-TCATAATGCTTGC-TCTGATAGGA-3'，反向引物 5'-GGCCAAAAAT-TTAATCAGTGGA-3'，扩增后目标片段长度为224 bp。PCR反应体系为:双蒸水17.8μL，10×扩增缓冲液(含Mg2+)2.5μL，正反向引物各0.5 μL(20 μmol/L)，DNA 模板1.5 μL，Tap DNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，dNTP 2.0 μL(10 mmol/L)，总体积25μL。PCR反应条件为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，59.2 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共 35个循环;继以72℃延伸8 min后结束。

1.2.3 电泳检测PCR产物 为明确PCR产物中有目标DNA片段，取PCR产物5μL与DNA加样缓冲液1.0μL混合后加样，以DNA标记物1.0μL作为分子对照，在6%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳并行AgNO3染色。

1.2.4 PCR产物的测序 将经电泳证实的PCR产物送苏州生物医药公司纯化并测序，所得结果与BRAF基因组DNA正常序列对比以确定有无点突变。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。两样本表达阳性率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

复发组原发灶BRAF基因T1799A位点V600E突变率为55%(11/20)，其中男4例、女7例，复发病灶突变率为50%(10/20)，其中男4例、女6例;1例原发灶BRAF基因为突变型，而复发灶为野生型。无复发组BRAF基因T1799A位点V600E突变率为25%(5/20)。复发组BRAF突变率高于无复发组(P 均 ＜0.05)。

3 讨论

已有研究显示，甲状腺乳头状癌的发生发展是一个多基因、多步骤的过程。80%的基因突变发生在RET/PTC-RAS-RAF-MARK途径中，其中 BRAF基因的突变率最高，约44%［2］。研究还发现，BRAF突变型甲状腺乳头状癌的组织侵袭力强［3］，容易浸润甲状腺周围组织，临床分期晚［4］。

研究表明，BRAF基因突变是导致MAPK信号通路异常激活的主要原因之一。目前已发现有超过40种BRAF基因突变类型。最常见的是T1799A位点的V600E变异，占90%以上。BRAF突变是否与肿瘤的恶性行为相关，目前尚有争议。而近年Oler等［5，6］的研究显示BRAF基因突变与碘代谢基因的低表达存在联系，显示BRAF可能与部分分化型甲状腺癌放疗中的“碘抗拒”有关［7］。在临床上，BRAF基因突变与甲状腺癌的关系已经得到了深入的研究。通过激活MAPK信号通路，BRAF基因V600E点突变有着很强力的致癌作用，如促进恶变细胞包膜外浸润，淋巴结转移等，已经得到很多实验的证实［8，9］。而 Kebebew 等［10］研究发现甲状腺乳头状癌中BRAF基因V600E突变者术后癌组织残留和复发风险高，与本研究的结果相符。

既往的观点认为，复发肿瘤与原发灶作为单细胞克隆，分子表型应该一致。但在乳腺癌等恶性肿瘤的研究显示，复发转移病灶雌激素受体表型可能出现变异。这方面研究在甲状腺癌领域尚属空白。本研究中1例患者复发灶BRAF基因T1799A位点基因型与原发灶不一致，提示甲状腺癌复发病灶BRAF分子表达与原发灶相比也可能存在变异，这有可能为未来复发性甲状腺癌的靶向治疗提供参考。

［1］钱碧云，陈可欣，何敏，等.天津市区甲状腺癌流行状况调查［J］.中国肿瘤临床，2005，32(4):218-221.

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［3］孟超，高洁，梁军，等.甲状腺乳头状癌并BRAFV600E突变及原癌基因重排蛋白表达与其侵袭性的关系［J］.中国医学科学院学报，2013，1:64-68.

［4］易文君，钟德玝，邹琼燕，等.BRAF基因突变与甲状腺乳头状癌的相关性［J］.中南大学学报(医学版)，2012，37(4):370-373.

［5］Oler G，Cerutti JM.High prevalence of BRAF mutation in a Brazilian cohort of patients with sporad ic papillary thyroid carcinomas:correlation with more aggressive phenotype and decreased expression of iodidem etabolizing genes［J］.Cancer，2009，115(5):972-980.

［6］王莎莎，林岩松，梁军，等.BRAF基因突变及其对分化型甲状腺癌钠碘同向转运体功能影响的研究进展［J］.中华肿瘤防治杂志，2011，18(18):1407-1410.

［7］崔邦平，代文莉，胡涛，等.甲状腺乳头状癌NIS蛋白表达对131I疗效的预测及与BRAF基因突变［J］.现代肿瘤医学，2013，21(4):746-748.

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［9］曹艳，石光清，向谷良.甲状腺癌中BRAFV600E突变的表达及意义［J］.放射免疫学杂志，2011，24(5):599-600.

［10］Kebebew E，Weng J，Bauer J，et al.The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer［J］.Ann Surg，2007，246(3):466-471.