小儿咽扁颗粒含量测定方法研究

刘安 秦孝波 黄艳

小儿咽扁颗粒为中药复方制剂, 其主要成分为金银花、射干、桔梗、人工牛黄、麦冬等, 功能：清热利咽, 解毒止痛。用于肺实热引起的咽喉肿痛, 咳嗽痰盛, 咽炎喉炎等。其中金银花为清热解毒、治疗喉痹的主要药物。金银花主要成分为绿原酸(花中可达5 %), 控制其含量十分重要。绿原酸具有抗氧化、抗菌抗病毒、治疗心血管疾以及抗癌变、免疫调节等作用。通过对不同检测波长、流动相、提取时间、提取溶剂、提取方法、溶剂用量的试验以及各种方法的结果准确度、精密度、稳定性和重现性的考察, 确定了高效液相方法测定绿原酸含量的可行性, 并选择出最佳测定方法。

1 试验材料

试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂, 以乙腈-0.4%磷酸溶液(12：88)为流动相, 柱温30℃, 流速1.0 ml/min, 检测波长为385 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量, 加甲醇制成每1 ml含0.084mg的溶液。供试品溶液的制备：精密取本品1 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加50%甲醇50 ml, 称重, 超声处理20min后, 放冷至室温, 再次称重, 用50%甲醇补充减失的重量, 摇匀, 用0.45 μm微孔滤膜滤过, 即得

2 试验方法及结果

2.1 检测波长的选择 取绿原酸对照品适量, 用甲醇溶解并稀释成每1 ml含0.084mg/ml的溶液, 在190 nm～400 nm的波长范围内扫描, 本品在327.8 nm处有最大吸收, 与中国药典金银花(含量测定)项下测定波长(327 nm)相近, 为保持一致, 故选择327 nm作为本品的检测波长［1］。

2.2 流动相的选择 流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(12：88)；柱温：30℃；流速：1 ml/min；在此条件下绿原酸与其他组分均达到基线分离, 而且峰形较好。

试验中曾用以下流动相进行试验：乙腈-0.4%磷酸溶液(13：87)(药典金银花《含量测定》项下流动相), 但绿原酸与相邻峰尚未达到基线分离。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 提取时间的考察 精密称取本品1.000 g(3份), 分别加入甲醇50 ml, 称重, 分别超声处理20、30、50min, 放冷,用甲醇补充减失的量, 摇匀, 滤过, 即得。吸取上述供试品溶液10 μl按拟定的条件测定。

2.3.2 提取方法的选择 精密称取本品2份：①精密加入甲醇50 ml, 称重, 分别超声提取50min, 放冷, 称重, 用甲醇补充减失的量, 摇匀, 滤过, 即得。②精密加入甲醇50 ml, 称重, 回流提取50min, 放冷, 称重, 用甲醇补充减失的量, 摇匀,滤过, 即得。

吸取上述各供试品溶液10 μl按拟定的条件测定, 结果表明, 超声20min提取效果较好。

2.3.3 提取溶剂的选择 精密称取本品1.0000 g2份：分别加入下表不同溶剂50 ml, 超声处理20min, 放冷。分别用不同溶剂补充减失的量, 摇匀, 滤过, 即得。

吸取上述各供试品溶液10 μl按拟定的条件测定, 结果表明, 50%甲醇提取效果较好。

2.3.4 溶剂用量的考察 精密称取1.0000 g3份：精密加入50%甲醇30 ml、50 ml、60 ml, 称重, 超声处理20min, 放冷,称重, 用50%甲醇补充减失的量, 摇匀, 滤过, 即得。

吸取上述各供试品溶液10 μl按拟定的条件测定, 结果表明, 50 ml与60 ml提取效果差异较小。

依据以上测定结果, 综合考虑提取效果, 最终选择50%甲醇50 ml超声处理20min作为本品的处理方法。

2.4 阴性溶液的制备 依据上述色谱条件分别吸取供试品溶液、50%的甲醇溶液、对照品溶液各10 μl进行测定, 供试品溶液和对照品溶液在相同的保留时间各有一个色谱峰,而50%的甲醇溶液在此保留时间无色谱峰［2］。

2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液(0.084mg/ml)1 μl、3 μl、6 μl、8 μl、14 μl按已拟定的色谱条件测定峰面积 , 以峰面积积分值为纵坐标, 绿原酸的量(μg)为横坐标绘制标准曲线, 计算得回归方程： y=59.040x-3.8625, r=0.9999。

实验表明, 绿原酸在0.084～1.176μg范围内呈良好的线性关系。

2.6 精密度 取绿原酸对照品溶液, 连续进样5次, 每次6 μl, 记录色谱图。结果表明, 仪器的精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液10 μl, 分别在0、2、4、6、8 h进样一次, 考察样品溶液的稳定性, 计算相对标准偏差, 结果表明, 供试品溶液在8 h内基本稳定。

2.8 重现性实验 精密称取样品(20071118)五份, 制成供试品溶液, 按拟定的色谱条件测定峰面积, 并计算含量, 计算相对标准偏差<5%, 结果表明, 本方法的重现性良好。

2.9 加样回收率 取已知含量的小儿咽扁颗粒(20071118)五份, 分别添加绿原酸对照品适量, 制成供试品溶液, 按上述色谱条件测定, 按以下公式计算回收率, 结果表明, 本法具有良好的回收率。

2.10 样品测定 分别精密吸取供试品溶液各10 μl, 依上述色谱条件测定, 依据绿原酸标准曲线计算含量。根据以上三批样品中测得的绿原酸含量, 暂定本品中含金银花以绿原酸(C16H18O9)计 , 不得低于 0.65mg/g。

3 讨论

本品为中药复方制剂, 其中金银花为本品中主要药物之一。金银花主要成分为绿原酸, 为进一步控制本品的质量,选择绿原酸为含量测定指标, 采用高效液相色谱法测定金银花中绿原酸的含量。本品原标准中, 没有含量测定项, 按此工艺条件制得的成品难已保证确切的疗效和均一的内在质量。为克服这些缺陷, 并对成品的质量控制进行了提高研究,并建立了绿原酸的高效液相含量测定方法, 使其具备了较详细的工艺参数和质量控制指标, 保证了药品的优良品质和确切的临床疗效。

根据实验结果得出实验结论为：此方法可以作为控制小儿咽扁颗粒产品的定量分析方法, 而且此方法重现性和稳定性良好。

［1］董宪凤.HPLC法测定精制银翘解毒片中绿原酸的含量.天津药学, 2006, 18(4):92.

［2］吴梅青, 刘佳佳.高效液相色谱法测定小儿咽扁颗粒中绿原酸的含量.黑龙江医药, 2007, 30(6):17-18.