VEGF、HIF-1在急性肺栓塞模型大鼠肺组织中的表达及相关性

陈 婷 朱晓良 杜紫燕

(苏州大学附属第二医院呼吸内科，江苏 苏州 215004)

肺血栓栓塞(PTE)发生机制主要为血栓性或者其他性质栓子(包括羊水、气体、脂肪)随体循环方向流动而造成肺动脉栓塞〔1，2〕。PTE的栓子主要来自下肢深静脉血栓，血栓或栓子直接堵塞造成肺动脉发生痉挛，肺血管床供血能力下降、供应面积减少，肺血管阻力逐渐增加并且肺动脉压逐渐增高〔3，4〕，危重者导致右心功能不全，甚至休克、死亡。血管内皮生长因子(VEGF)是促进并且诱导特异性血管内皮细胞生长的细胞因子，在血管生成过程中起到了重要的作用〔5〕。缺氧诱导因子-1(HIF-1)主要作用有促进血管生成，同时对体内氧气运输及通气进行调节，同时对各种酶的酵解作用进行调控以利于提高机体对缺氧的耐受能力〔6〕。本文制备大鼠急性肺栓塞(APE)模型并研究VEGF、HIF-1表达水平。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重为200～220 g，大鼠均由大连医科大学动物实验中心提供，包括兔抗大鼠多克隆抗体、兔抗大鼠单克隆抗体VEGF一抗、HIF-1一抗及链霉素合素以生物素复合物(SABC)试剂盒等均由美国Sigma公司提供。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自武汉博士德。

1.2 实验方法 建立APE大鼠模型，采用改良右心导管术建立自体血栓APE大鼠模型〔7〕:腹腔注射20%乌拉坦6 ml/kg麻醉，必要时追加0.5 ml/h，无菌条件下沿颈前正中线做长约2 cm切口，钝性分离右颈外静脉，插管接YP100型压力传感器，量程为(－10～10 KPa)，动态监测肺动脉压变化。从颈动脉采血1 ml，迅速注入聚乙烯导管内。室温下放置30 min左右，在凝固后加入生理盐水，制备直径0.8～0.9 mm、长10 mm的自体血栓。取50只Wistar大鼠，正常组10只，其余40只按取肺组织时间不同，分为 1、6、12、24 h四组，每组 10只。大鼠采用10 g/L戊巴比妥1.2 ml进行麻醉，从颈总静脉插管将栓子注入，注栓速度为0.5 ml/s，保持肺动脉收缩压持续为50 mmHg，每只注入3个栓子，正常对照组注入等量的生理盐水。采用正常组为对照，在1、6、12及24 h分别进行开胸留取肺组织。

1.3 免疫组化学法 用4%水合氯醛以10 ml/kg腹腔注射麻醉后开胸，将针头插入左心室，剪开右心耳，先用200 ml生理盐水灌流将血冲净，然后用250 ml的4%多聚甲醛灌流固定，取组织，石蜡包埋。切片常规脱蜡至水，30%H2O2阻断，枸橼酸盐缓冲液加热抗原修复，5%胎牛血清(BSA)封闭，37℃下放置30 min，滴加稀释的一抗(按1∶200稀释)，4℃过夜。次日依操作顺序加入二抗及SABC，室温DAB显色，封片后应用显微镜观察。

1.4 结果判定 HIF-1α阳性结果显示为镜下出现细胞核或者胞浆内有棕黄色颗粒，并根据染色强度进行打分:无色(0分)，浅黄色(1分)，棕黄色(2分)，棕褐色(3分);再依据阳性细胞所占百分比进行打分:阳性细胞＜5(0分)，5～25(1分)，25～50(2分)，50～75(3分)，＞75(4分);染色强度同阳性细胞百分比乘积进行评分:9～12分(强阳性⧺)，5～8分是弱阳性(+)，0～4分是阴性(－)，VEGF阳性细胞判定主要依据Takahashi等实验方法依据细胞浆或者胞膜镜下棕黄色者为阳性，将VEGF表达共可分为(－)～(⧻)4级。采用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统测定实验切片的光密度值，取平均值。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行分析，均值比较应用单因素方差分析，而HIF-1和VEGF之间的相关性应用直线相关分析。

2 结果

2.1 模型制备结果 制备APE大鼠模型过程中，仅有2只死亡，其制备成功率为95%(38/40)，注入栓子5 min左右，大鼠的肺动脉压明显升高，并出现呼吸加深加快，30次/min，口唇紫绀，活动明显减少，多为俯卧位，双肺弥漫性干湿啰音等肺栓塞体征。经颈静脉注栓后1 h，自颈外静脉给予放射性核素99 mTC-MAA，术后经ECT肺灌注扫描显示双肺呈明显放射性充盈及缺损。随时间的延长，大鼠逐渐适应缺氧现象，24 h后活动量逐渐增加。苏木素一伊红(HE)染色可见肺动脉及小血管内存在大小不等的栓子，周围有大量炎性细胞聚集，伴血管内膜不同程度水肿及局部肺组织实质变。

2.2 HIF-1α和VEGF的表达 正常组大鼠肺组织内显示无HIF-1α表达，而实验组大鼠的肺组织在细胞胞核及胞浆内于各个时间点均显示 HIF-1α表达(阳性率100%)，强度为(⧺)～(⧻)，VEGF、HIF-1蛋白表达水平均升高，与对照组相比较，其差异有统计学意义(t1=4.274，t2=5.137，均 P＜0.05)，表达强度与时间呈正相关，在模型制作12 h时升高最为显著。通过观察栓塞后大鼠肺组织中HIF-1α和VEGF在各个时间点的表达，发现其两者表达强度呈正相关(r=0.800，P＜0.05)。见表1，表2。

表1 HIF-1α在大鼠肺组织内的表达(n=10)

表2 VEGF在大鼠肺组织内的表达(n=10)

3 讨论

本研究结果表明PTE疾病介导的缺氧肺组织中主要存在HIF-1α，其主要通过对VEGF表达调节来降低肺细胞的耗氧量，从而在缺氧状态下增强肺细胞的耐受能力，增强肺细胞耐缺氧能力。

VEGF主要作用包括促进血管内皮生长及侧支循环的建立，在血管生成中起到关键作用，作为具有高度特异性受体的血管内皮细胞因子，主要和特异性受体flk-1相结合，发挥介导血管内皮细胞增殖及分化作用;利于血管通透性增加并同时参与新生血管形成。缺氧是刺激VEGF生成的最关键因素。经研究证实〔8，9〕，在低氧环境中 VEGF mRNA及 VEGF蛋白表达较高，显示新生血管的生成及其侧支循环的建立是通过对VEGF基因表达的调控达到最终目的。位于血管内皮细胞的VEGF受体可经VEGF因子激活，从而激活下游系列缺血相关通路起诱导新生血管生成及侧支循环建立〔10〕。

综上所述，在APE模型中VEGF、HIF-1均可作为治疗靶点，且HIF-1表达可能起到启动作用，临床治疗可以参照相关理论依据进行靶点治疗，保护肺组织。

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