绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因克隆与系统发育分析

刘红彬 顾小龙

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

Wels等〔1〕构建的免疫毒素可使裸鼠体内的移植瘤消退。由美国国立癌症研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病临床试验中更显示了“生物魔弹”的神奇威力〔2〕。绿脓杆菌外毒素(PE)是有效的细胞杀伤剂，只要一个毒素分子进入细胞质就足以杀死细胞。PE是613肽的单链毒素蛋白，通过细胞识别区和跨膜区将具有ADP-核糖基化活性的毒性区导入细胞，催化细胞内的延伸因子(EF-2)发生ADP-核糖基化反应，使EF-2灭活而杀死细胞。据Hwang等〔3〕报道，缺失Ⅰa区的PE分子(即PE40)对培养细胞的毒性很低，但却具有完全的毒性活性，将PE40与抗体或生长因子等导向分子连接，能选择性杀伤特定靶细胞。因此，PE40作为毒素弹头基因广泛用于免疫毒素的研究〔4～6〕。利用PCR技术从绿脓杆菌ATCC9027基因组DNA中扩增PE40基因，与pMD18-T simple载体连接后测序，获得用于构建分子免疫毒素的毒素弹头基因PE40。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒 绿脓杆菌ATCC9027，购自广东省微生物菌种保藏中心。感受态大肠杆菌JM109和pMD18-T simple vector购自宝生物大连公司。

1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、内切酶HindⅢ和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司。

1.3 引物 根据绿脓杆菌标准毒株PA103外毒素基因序列〔7〕，自行设计引物，上下游引物引入HindⅢ酶切位点，目的是为了将PE40亚克隆至表达载体，致上下游引物分别长33 bp和 31 bp。上游引物:5'-AAGCTTATGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACC-3';下游引物:5'-AAGCTTCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGGTTTG-3';引物由上海生物工程有限公司合成

1.4 绿脓杆菌ATCC9027基因组DNA的制备 酚/氯仿法。

1.5 PCR反应体系 2.5μl 10×PCR扩增缓冲液，2μl dNTP混合物(10 mmol/L)，上下游引物各 0.5μl，1μlDNA模板(20 ng)，Taq DNA聚合酶0.5 μl，50%甘油5 μl，灭菌水13 μl，总体积25μl。反应条件:94℃预变性5 min，接着进入循环，94℃变性1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸 1.5 min，共循环 30个周期，72℃终末延伸10 min。取5μl PCR产物，在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，美国伯乐凝胶成像系统拍照。

1.6 克隆PE40 纯化PCR产物与PMD18-T simple载体16℃连接3 h，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化菌液均匀涂布于含Amp、IPTG和X-Gal的LB平板上，37℃培养过夜，蓝白斑筛选阳性克隆，将此克隆质粒命名为pT-PE40。克隆质粒经HindⅢ酶切鉴定后测序。

1.7 序列比对 将获得的PE40基因序列在Genbank中进行blast搜索，下载一致性高的PE基因序列，以PE40基因序列为内群，以白喉毒素基因为外群进行系统发育分析。用ClustalX(2.0)软件进行多序列比对，多序列比对参数为:空位开放罚分15;空位延伸罚分6.66;DNA转换权重0.5;延迟趋异序列30%。比对结果用MegA 4.0软件的邻接法(Neighbor-Joining)绘制系统发育树。

2 结果

2.1 甘油对PCR的影响 绿脓杆菌外毒素基因PE40基因片段G+C含量高达72.56%，PE40基因片段的扩增必须依赖于一定浓度的甘油。不加甘油时，PE40基因片段不能被成功扩增;而甘油浓度超过20%时，PE40基因片段也不能被成功扩增。甘油浓度为10%时，经扩增得到的PE40基因片段量最多。见图1。

图1 甘油对PCR的影响

2.2 克隆绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因 纯化PCR产物与PMD18-T simple载体连接，电泳结果显示阳性克隆质粒为3 790 bp。见图2。

2.3 酶切鉴定 酶切产物电泳结果显示2条带，T载体片段长2 322 bp，PE40片段长1 088 bp。见图3。

2.4 绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因序列碱基突变分析 绿脓杆菌国际标准毒株被命名为PA103，ATCC9027与PA103的PE40进行核苷酸比对，一致性为98.8%，ATCC9027产生了14个碱基的突变，由此导致8个氨基酸的突变，对应PA103外毒素蛋白一级序列为:甘胺酸354(GGC)→丝氨酸341(AGC)，丙氨酸362(GCG)→谷氨酸346(GAG)，天冬酰胺364(AAC)→丝氨酸364(AGC)，缬氨酸Val419(GTG)→谷氨酸419(GAG)，丝氨酸506(TCG)→色氨酸506(TGG)，苏氨酸514(ACC)→丙氨酸514(GCC)，丝氨酸515(AGC)→甘氨酸515(GGC)，亮氨酸Leu556(CTC)→脯氨酸556(CCC)。

2.5 绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因系统发育分析下载的 PE基因序列有 AE004091，AY585869，CP000438，EU595734， EU595736， FM209186， K01397， U78761 和AY820132。另在以前的研究中获得绿脓杆菌 ATCC27853的PE40基因序列。将这10条序列及ATCC9027的PE40基因序列作为内群，以白喉毒素为外群进行系统发育分析，绘制系统发育树。系统发育树显示绿脓杆菌外毒素PE40基因系形成单系群。绿脓杆菌ATCC9027与ATCC27853的PE40基因处于一个分支，说明二者的亲缘关系近。

图2 p T-PE40电泳结果

图3 p T-PE40的HindⅢ酶切结果

3 讨论

绿脓杆菌能分泌多种与毒力有关的细胞外物质，其中以外毒素A最为重要。外毒素A机制与白喉毒素有些类似，即修饰肽链延伸因子-2(EF-2)，使之发生ADP-核糖基化，致蛋白质生物合成停止从而杀死细胞〔8〕。Arg276和Arg279是毒素跨膜转运的关键性位点。ADP-核糖基化的关键位点有谷氨酸553、组氨酸426、组氨酸440、色氨酸466、精氨酸458、精氨酸467、酪氨酸481、精氨酸486-492，绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因的测序结果表明，以上关键位点的氨基酸均未发生突变，产生变化的8个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点，这些突变不会对 PEA的酶活性及细胞毒性产生影响，因此，来自ATCC9027的PE40基因可用于构建免疫毒素。

PE构建的免疫毒素，已在恶性肿瘤和艾滋病的导向治疗〔4～6，9〕中取得了巨大的成功，其中重组免疫毒素制剂 ONTAK已被美国FDA批准上市，另美国国立癌症研究所研制的新型免疫毒素BL22，在白血病临床试验中显示了“生物魔弹”的神奇威力。还可利用PE开发绿脓杆菌疫苗，其是一种很好的疫苗蛋白，不论制成无毒的PE片段或与其他抗原融合，都可以运用到疫苗发展上。针对肝癌细胞的治疗方面，利用PEA能够携带蛋白质或DNA进入细胞中的特殊功能，可以开发出极佳的基因治疗工具或蛋白质治疗药物。随着分子生物学的发展，将会有更多、效果更好的免疫毒素用于肿瘤的治疗。

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