炎性反应与细胞凋亡在脑梗死后的动态变化及其机制

王学慧 毛旭强

(南京医科大学附属无锡市人民医院，江苏 无锡 214008)

缺血性脑梗死是一种致残和致死率较高的脑血管疾病，好发于老年人。在缺血性脑损伤中，多种凋亡诱导信号是造成神经细胞凋亡的重要原因。其中炎性因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α和细胞凋亡因子Bcl-2与其最为密切相关〔1〕。有研究表明，局灶性脑缺血时，过度的炎性反应会对机体及患者的预后产生不良影响。但目前，炎性因子和细胞凋亡因子的动态变化对脑梗死后神经细胞凋亡的关系尚未阐明〔2〕。本研究旨在探讨炎性因子IL-1β、TNF-α和Bcl-2在脑梗死后的动态变化，揭示脑缺血/再灌注时神经细胞损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD雄性大鼠，8～9周龄，体重280～320 g，由广东医学院实验动物中心提供;IL-1β双抗体一步夹心法ELISA检测试剂盒由上海逸峰生物科技有限公司提供;TNF-α双抗体一步夹心法ELISA检测试剂盒由上海研吉生物科技有限公司提供;TUNEL试剂盒由Roche公司提供;兔抗Bcl-2抗体由福州迈新生物技术开发有限公司提供。

1.2 脑梗死大鼠模型制备 将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组及再灌注6、12、24、48和96 h组，大鼠模型制备前禁食不禁水12 h，并在室温环境下，腹腔注射1.0%戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉。参照Longa等〔3〕的方法，采用插线法致大鼠大脑中动脉栓塞2 h。模型组大鼠仰卧固定在手术台，消毒后行颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA和ECA近心端处永久结扎，临时夹闭ICA，在CCA近分叉处剪一斜行切口，并缓慢插入尼龙线，至1.8～2.1 cm处遇到阻挡感时即停止插线，从而造成大脑中动脉局灶性缺血，梗死2 h后，拔出线栓。假手术组除不插入尼龙线外，其余操作与模型组一样。并分别在再灌注6、12、24、48和96 h对部分大鼠取腹主动脉血，另一部分大鼠断头取脑，石蜡包埋。

1.3 检测方法

1.3.1 IL-1β和TNF-α的检测 各组大鼠在手术结束时，剥离右侧大脑皮质制备匀浆液，取上清液进行蛋白定量。分别按照IL-1β、TNF-α双抗体一步夹心法ELISA检测试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.2 组织病理学观察与TUNEL法检测细胞凋亡 部分石蜡常规脱蜡至水，然后行HE染色，脱水，封片，在光学显微镜下即可观察脑细胞形态学变化并拍照。另取部分石蜡切片经脱蜡、水合后，按TUNEL试剂盒使用说明书进行操作，以染成深棕色的为凋亡细胞，在光学显微镜下即可观察。选取20倍物镜拍照，采用阳性染色像素计数计算凋亡细胞总数。

1.3.3 免疫组织化学法 部分石蜡切片脱蜡至水，放入3%H2O2室温孵育 5 min，再移入 10 mmol/L PBS浸泡 2次(5 min/次)后，置入5%山羊血清，室温孵育10 min。滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。10 mmol/L PBS冲洗3次(5 min/次)后，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS冲洗3次(5 min/次)后，滴加辣根酶复合物工作液，37℃孵育30 min。10 mmol/L PBS冲洗3次(5 min/次)后，滴加DAB显色剂显色5～15 min(由染色程度决定显色时间)。自来水充分冲洗、脱水、透明、封片。

1.4 统计学方法 应用SPSS16.0软件，计量资料采用表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 炎性反应在脑梗死后的动态变化 IL-1β水平在再灌注6 h显著升高，在12 h达到最高，24 h则开始下降，但仍显著高于假手术组的水平(P＜0.05或P＜0.01);与假手术组比较，TNF-α在再灌注6、12 h无明显变化，在24 h显著升高(P＜0.05)，48 h达到最高(P＜0.01)。见表1。

2.2 细胞凋亡在脑梗死后的动态变化 神经细胞数量在再灌注6 h显著降低(P＜0.05)，至48 h降到峰值(P＜0.01)，96 h后已基本恢复;细胞凋亡数量在再灌注6 h开始升高，到24 h达到最高，48 h开始下降，至96 h仍显著高于假手术组的数量(P＜0.01);Bcl-2表达在再灌注6 h开始降低，以后各时相持续下降 ，显著低于假手术组(P＜0.01)。见表2。

表1 IL-1β、TNF-α水平在脑梗死后的动态变化(，n=10)

表1 IL-1β、TNF-α水平在脑梗死后的动态变化(，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

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表2 神经细胞数量、细胞凋亡及bcl-2表达在脑梗死后的动态变化，个/mm2)

表2 神经细胞数量、细胞凋亡及bcl-2表达在脑梗死后的动态变化，个/mm2)

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3 讨论

在缺血性脑梗死患者中，神经细胞死亡的方式有坏死和凋亡。而在发生缺血性脑梗死的整个病程中，神经细胞的死亡方式同时存在坏死和凋亡〔4〕。为进一步阐明脑缺血/再灌注时神经细胞损伤的机制，指导临床研发抗缺血再灌注性脑损伤药物，从而在有效防治脑梗死方面带来一定的医用价值，因此，本文通过建立局灶性脑缺血大鼠模型，并在再灌注6、12、24、48和96 h 5个时相点观察炎性反应与细胞凋亡的动态变化及探讨其内在机制。

本研究结果说明在局灶性缺血6 h后，神经细胞死亡的方式主要是坏死;而在以后时间点，神经细胞数量减少与细胞凋亡增加互相吻合，提示在急性缺血性脑梗死后期，经细胞死亡的方式主要是凋亡〔5〕。

IL-1β是一种促炎性细胞因子，能通过间接增加白细胞，增强炎性反应，从而加重缺血性脑损伤，最终诱导神经细胞凋亡〔6〕。本研究结果说明过度的炎性反应会增加细胞凋亡数量。TNF-α亦是一种促炎性细胞因子，可广泛参与炎性反应。局灶性脑缺血后，神经元及小胶质细胞等均可使TNF-α水平升高，从而加重脑组织损伤〔7〕。本研究结果说明神经细胞凋亡数量的增加可能与过高的TNF-α水平有关。Bcl-2是一种抗凋亡因子，对缺血脑组织细胞具有保护作用，能够对细胞凋亡起到抑制作用〔8，9〕。神经细胞凋亡与Bcl-2水平表达过低有关，抗凋亡因子bcl-2对细胞凋亡的抑制作用可能仅是一种生理保护作用〔10〕。

综上所述，缺血性脑梗死后神经细胞凋亡的动态变化可能与炎性因子IL-1β、TNF-α水平的升降及Bcl-2的表达有关。

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