原发性肝癌高迁移率族蛋白B1表达改变及其机制

王婷婷，韩菲菲，梁加贝，王发龙，陈国千＊

（南京医科大学附属无锡人民医院1.医学检验科；2.病理科，江苏 无锡214023）

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）为主要存在于细胞核中的一种非组蛋白，参与核内多种功能。许多种类细胞受诱导因素诱导后可以胞外释放HMGB1，胞外HMGB1参与介导炎症反应，并与细胞增殖、细胞分化、细胞迁移等有关［1］。近年研究［2］表明，HMGB1在肿瘤的发生、发展中具有重要作用，但原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）组织 HMGB1的表达改变及其血清HMGB1水平检测和临床意义研究报道甚少，肝癌细胞HMGB1释放机制尚未见探讨。本文就原发性肝癌HMGB1表达改变及其机制进行初步实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

48例健康对照者为本院体检人群的健康者，38例慢性乙肝、32例乙肝后肝硬化和23例继发性肝癌患者来自本院门诊和住院部，年龄29－60岁；继发性肝癌患者的原发癌有胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胆囊癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌等。39例PHC患者来自本院住院部，均为初次入院、未经治疗者，并经组织病理学证实，年龄32－64岁，其中肿瘤大小＜2cm 14例、≥2cm 25例，TNM分期Ⅰ或Ⅱ期17例、Ⅲ或Ⅳ期22例。人肝癌细胞株SMMC－7721购自中国科学院细胞库。DMEM高糖培养液为Sigma公司产品。

1.2 HMGB1mRNA表达量检测

按Trizol试剂说明书提取肝组织或肝细胞中总RNA后进行逆转录反应，cDNA产物置－20℃保存。使用ABI－7500荧光定量PCR仪进行扩增，PCR参数为95℃预变性30sec、95℃变性5sec、60℃退火延伸34sec，循环40次。HMGB1引物：F 5’－GATCCCAATGCACCCAAGAG－3’，R 5’－TCGCAACATCACCAATGGAC－3’；GAPDH 引物：F 5’－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3’，R 5 ’－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3 ’。 以HMGB1和 GAPDH 的 Ct值之差（△Ct）作为HMGB1mRNA相对表达水平的指标。

1.3 细胞培养实验

SMMC－7721细胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液在CO2培养箱中常规培养（37℃，5%CO2、95%空气），细胞贴壁覆盖达80%－90%时进行细胞实验。缺氧组置于YCP－50S三气培养箱中培养（37℃，5%CO2、1%O2、94%N2），常氧组进行常规培养。各组实验均重复8次。

1.4 培养上清液HMGB1含量测定

血清或培养上清液中HMGB1含量使用HMGB1ELISA试剂盒（Shino－Test公司）检测，按产品使用说明书操作。

1.5 统计学分析

使用SPSS 18.0统计软件包，两组间均数比较采用双侧Satterthwaite近似法t检验或配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两指标变量关系采用Spearman相关系数进行相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PHC患者血清HMGB1水平的改变

健康对照、慢性乙肝、乙肝后肝硬化、继发性肝癌和PHC各组的血清HMGB1水平分别为3.9±1.4、4.6±1.8、6.3±2.8、17.2±6.7和 13.5±6.3 μg／L，肝病各组血清HMGB1水平升高，尤以继发性肝癌组和PHC组升高显著，且继发性肝癌组高于PHC 组 （P＜0.05），见 图 1。PHC 组 血 清HMGB1水平与血清甲胎蛋白水平之间具有正相关性（r＝0.614，P＜0.01）。PHC组TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期患者血清 HMGB1水平（16.4±6.4μg／L）明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者（9.7±4.0μg／L）（P＜0.01）。

图1 肝病患者血清HMGB1水平

2.2 PHC组织中HMGB1基因表达的改变

通过RT－PCR检测，11例PHC（TNM 分期为Ⅲ、Ⅳ期）组织中 HMGB1mRNA相对表达水平（△Ct）（2.91±0.56）较癌旁组织（4.73±0.95）明显增强（P＜0.01）。

2.3 缺氧对肝癌细胞HMGB1基因表达和胞外释放的影响

SMMC－7721细胞经缺氧培养6h后，HMGB1 mRNA表达明显增强（P＜0.01），并随时间延长而增强，见图2；而在常氧培养24h内，HMGB1mRNA表达无显著性改变。经缺氧培养3h后，培养上清液中HMGB1含量即见时间依赖性升高，见表1。

图2 缺氧对肝癌细胞HMGB1mRNA表达的影响

表1 缺氧对肝癌细胞培养上清液中HMGB1含量的影响（μg／L，±s）

表1 缺氧对肝癌细胞培养上清液中HMGB1含量的影响（μg／L，±s）

注：／未检出；与常氧组比较，＊P＜0.01

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3 讨论

PHC是最常见的恶性肿瘤之一，尤其在中国，病例数占全球的半数以上。近十多年来，虽然PHC的早期诊断技术和治疗手段有了明显的提高和改善，但PHC患者的预后仍然较差［3］。PHC的发生、发展是一个复杂的生物学过程，其分子机制有待深入研究。HMGB1为一种主要位于细胞核内与DNA非特异性结合、进化高度保守的非组蛋白，分子量约30kDa，参与核内基因转录、DNA重组和修复、核小体构建和稳定以及类固醇激素调控等，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而得名［1］。诸多研究［1］表明，许多种类细胞如免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞等受胞外诱导因素（如脂多糖、干扰素－γ、生物活性脂、缺氧等）诱导后可主动分泌HMGB1，分泌后的胞外HMGB1参与介导炎症免疫反应、细胞增殖、细胞分化、细胞迁移等。

近年研究［2］显示，发生恶性肿瘤时，由于肿瘤细胞基因表达和肿瘤组织微环境的改变，肿瘤组织细胞HMGB1通常表达增强和释放增多，HMGB1与肿瘤的发生、生长、浸润和转移等有着密切关系。Dong等［4］报道，PHC组织中的 HMGB1基因和蛋白表达明显增强，其表达水平与肿瘤病理学分级、远处转移有关；利用shRNA敲除人肝癌细胞株HMGB1基因后，基质金属蛋白酶－2表达下调，细胞增殖活性和迁移能力下降。Yan等［5］研究结果显示，PHC组织和细胞HMGB1高表达，HMGB1通过TLR4和RAGE信号通路诱导半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1）活化，后者介导若干炎症介质产生，并促进肿瘤侵袭和转移。本研究结果显示，PHC（TNM分期为Ⅲ、Ⅳ期）组织中的HMGB1基因表达显著高于对应的癌旁组织，与以上学者的研究结果一致。肝癌患者血清HMGB1水平的变化及其意义研究较少，Cheng等［5］报道，PHC患者血清HMGB1水平（84.2±50.4ng／ml）高于健康者（7.0±5.9ng／ml），本研究结果显示，PHC患者血清HMGB1水平（13.5±6.3ng／ml）明显升高，并与其TNM分期有关，但结果值明显低于Cheng的报道结果，可能与前者采用蛋白印迹法检测有关。结果也显示，继发性肝癌患者血清HMGB1水平显著升高，可能与继发性肝癌患者为晚期癌症并存在多处肿瘤有关，并提示其它肿瘤组织细胞HMGB1表达或释放增多。

肿瘤组织HMGB1表达增强的分子机制迄今未见研究报道，本实验结果表明缺氧状态对肝癌细胞HMGB1基因表达和胞外释放有明显影响。肿瘤组织因细胞增殖过快、血管分布紊乱和结构异常而常处于缺氧微坏境中，我们前期研究［7，8］结果也显示，缺氧可以诱导巨噬细胞、肺成纤维细胞等HMGB1基因表达和胞外释放，提示肿瘤组织HMGB1表达增强与其发生的缺氧微坏境有关。

血清HMGB1作为潜在的肝癌标志物值得关注和进一步研究。

［1］Naglova H，Bucova M.HMGB1and its physiological and pathological roles［J］.Bratisl Lek Listy，2012，113（3）：163.

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［3］Tinkle CL，Haas－Kogan D.Hepatocellular carcinoma：natural history，current management，and emerging tools［J］.Biologics，2012，6：207.

［4］Dong YD，Cui L，Peng CH，et al.Expression and clinical significance of HMGB1in human liver cancer：Knockdown inhibits tumor growth and metastasis in vitro and in vivo［J］.Oncol Rep，2013，29（1）：87.

［5］Yan W，Chang Y，Liang X，et al.High－mobility group box 1activates caspase－1and promotes hepatocellular carcinoma invasiveness and metastases［J］.Hepatology，2012，55（6）：1863.

［6］Cheng BQ，Jia CQ，Liu CT，et al.Serum high mobility group box chromosomal protein 1is associated with clinicopathologic features in patients with hepatocellular carcinoma［J］.Dig Liver Dis，2008，40（6）：446.

［7］刘鸿生，刘 洁，韩菲菲，等.缺氧诱导人肺成纤维细胞释放高迁移率族蛋白B1［J］.实用医学杂志，2012，28（6）：868.

［8］李 蕾，韩菲菲，王发龙，等.缺氧对巨噬细胞HMGB1释放的影响及其机制［J］.中国实验诊断学，2012，16（5）：761.