β－catenin和MMP－2在非小细胞肺癌中的表达及意义

孔康宝，李光虎，杨 波，崔永生

（吉林大学第一医院 胸外科，吉林 长春130021）

肺癌作为一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来一直呈上升趋势，并且死亡率已成为各种肿瘤之首。肺癌的发生是多因素、多基因、多阶段共同参与的结果，其中细胞信号Wnt途径转导对其发生、发展起着至关重要的作用。近年来研究中发现在肿瘤细胞中β－catenin的异常蓄积，且其异常蓄积的程度与肿瘤的发生、发展、浸润、转移有关。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基质金属蛋白酶－2）是基质金属蛋白酶家族成员之一，其主要通过降解细胞外基质中的胶原蛋白（主要是IV型胶原蛋白）促进肿瘤细胞转移。目前关于MMP－2在肺癌组织中的表达情况及其与β－catenin的相互关系的研究甚少，为此，本实验对肺鳞癌和肺腺癌及正常肺组织中的β－catenin和MMP－2的表达情况进行研究，并分析二者与临床病理因素的关系，以探讨它们在肺癌发生发展中的作用与意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2012年4月至8月在吉林大学第一医院胸外科手术切除的肺癌组织标本，对其中资料完整的39例进行研究，术前均未进行放化疗。其中，男性27例，女性12例，年龄43－76岁，平均年龄59岁；经病理证实的鳞癌19例，腺癌20例；有淋巴结转移者18例，无淋巴结转移者21例；肿物大小＜3cm×3cm×3cm者12例，≥3cm×3cm×3cm者27例；另取8例正常肺组织作为对照。

1.2 主要试剂 β－catenin鼠抗人单克隆抗体及免疫组化试剂盒和MMP－2单克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片，经脱蜡、脱苯、水化后，采用链菌素抗生物素蛋白－过氧化物酶免疫组化法（S－P法）检测 β－catenin蛋白表达。以 0.01%mol／L PBS代替一抗作为阴性对照。已知阳性肺癌组织作阳性对照。

1.4 结果判定 β－catenin蛋白棕黄色颗粒定位于胞膜和胞质。有棕黄色颗粒为＋，无棕黄色颗粒为－。MMP－2棕黄色颗粒主要定位于癌细胞胞质中，间质细胞内亦有不同程度的表达。有棕黄色颗粒为＋，无棕黄色颗粒为－。

1.5 结果统计 通过整理染色标本的临床资料、病理资料并将其与细胞计数结果录入Excel和SPSS表格，我们用SPSS13.0软件对实验结果进行统计学分析（不同临床病理特征比较采用χ2检验和Fisher精确概率法检验，表达相关性采用Spearman等级相关分析）。

2 结果

2.1 β－catenin的表达及其与不同临床病理特征之间的关系

β－catenin蛋白棕黄色颗粒定位于胞膜和胞质。β－catenin在肺癌组织中的胞质表达明显高于对照组，差异具有显著性（P＜0.05，表1，图1）。肺癌组织中β－catenin的表达与患者性别和年龄、肿物大小之间的差异均无显著性（P＞0.05），在 N1－2组和N0组肺癌组织中的表达差异亦无显著性（P＞0.05）；但肺鳞癌组织中β－catenin的胞质表达低于肺腺癌，胞膜表达高于肺腺癌，差异具有显著性（P＜0.05，表2）。

表1 肺癌与正常对照组β－catenin和MMP－2胞质表达的关系

图1 A肺鳞癌组织中β－catenin的表达 B肺腺癌组织中β－catenin的表达 C对照组中β－catenin的表达（均×400）

2.2 MMP－2的表达及其与不同临床病理特征之间的关系

MMP－2棕黄色颗粒主要定位于癌细胞胞质中，间质细胞内亦有不同程度的表达。和β－catenin一样，MMP－2在肺癌组织中的胞质表达明显高于对照组，差异具有显著性（表1，图2）。在肺癌组织中，MMP－2的表达与患者性别和年龄、肺癌组织类型、肿物大小无关（P＞0.05）；但 N1－2肺癌组 MMP－2的表达明显高于N0肺癌组，差异具有显著性（P＜0.05，表3）。

表2 肺癌组织临床病理特征与β－catenin表达的关系

图2 D肺鳞癌组织中MMP－2的表达 E肺腺癌组织中MMP－2的表达 F对照组中MMP－2的表达（D、E×400，F×200）

表3 肺癌组织临床病理特征与MMP－2胞质表达的关系

2.3 肺癌组织中β－catenin与 MMP－2表达之间的关系

采用Spearman等级相关检验对肺癌组织中βcatenin与MMP－2表达之间的关系进行分析，发现二者不具有相关关系（P＞0.05，表4）。

表4 肺癌组织中β－catenin与MMP－2表达之间的关系

3 讨论

肺癌的发病机制复杂，是多因素参与、多阶段发展的过程，其转移是肿瘤细胞与细胞外基质相互作用的复杂的、多步骤的连续过程［1］。在诸多相关基因中，β－catenin在细胞间黏附和细胞内增殖信号转导过程中起双重作用［2］，一方面，它在上皮钙粘粘素—连环素复合体（E－cad－cat complex）中发挥桥梁作用，其一端与E－cadherin的细胞浆区结合，另一端与α－cadharin结合，而后者又与细胞内的肌动蛋白骨架系统相连，从而构成一套完整的细胞黏附系统，其主要功能是保持上皮组织的完整性，防止肿瘤细胞离散、脱落起重要作用。另一方面，β－catenin也是Wnt／β－catenin信号传导通路中的关键分子［3］。当Wnt信号存在时，Wnt蛋白与卷曲蛋白胞外区结合，在辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6协同作用下，胞质中Dsh蛋白被募集至胞膜下，使糖原合酶激酶3β磷酸化失活并从轴蛋白上脱落，则βcatenin不能被降解，大量游离的β－catenin在胞质中聚集并进入胞核内与转录因子T细胞因子／淋巴细胞增强因子结合，导致 Wnt靶基因（c－myc，cyclinD1等）的转录，继而导致细胞异常增殖和肿瘤的发生。

近年来，一系列研究证实，Wnt通路在肿瘤发生中起到重要作用，由于β－catenin在细胞黏附和增殖过程中的双重作用，其表达异常对很多肿瘤的发生和发展具有重要的促进作用［4－7］。目前国内外已有许多实验［8－11］都表明肺癌组织中β－catenin异常表达与非小细胞肺癌的分化、分期、转移密切相关。Retera等［10］的研究显示，β－catenin的膜表达水平降低与肺癌的淋巴结转移有关，可作为具有统计学意义的预后分子。最近由Xi－Qing Li等［12］报道的文献中，显示胞膜低表达β－catenin的肺癌患者生存率较正常表达者为低，且检测β－catenin的胞质或胞核的异位表达对非小细胞肺癌具有重要临床意义。βcatenin异常表达的原因很多，其中β－catenin基因外显子3的突变是很多肿瘤中β－catenin异常蓄积的重要原因。β－catenin基因第三外显子包含Ser29、Ser33、Ser37、Thr41、Ser45等突变热点密码子。这些密码子编码的丝（苏）氨酸能够直接被GSK－3β磷酸化，因此，这些位点的突变可影响βcatenin的降解，导致游离的β－catenin蓄积，引起细胞异常增殖。但是，徐洪涛［11］等对53例NSCLC标本β－catenin基因第3外显子进行了PCR扩增及测序，均未发现突变，证明β－catenin基因第3外显子的突变在NSCLC中很少见。这些结果表明，在NSCLC中β－catenin基因第3外显子的突变不是βcatenin异常表达的主要原因。β－catenin降解过程中任何异常都有可能造成β－catenin在胞质中的蓄积。

本实验研究结果表明，肺癌胞质中β－catenin表达明显高于对照组，这说明β－catenin作为Wnt信号传导通路中的关键分子，在胞质中的异常表达可能对肺癌的发生具有促进作用。患者性别、年龄、肿物大小及淋巴结转移与肺癌组织中β－catenin的表达无关，这与部分文献描述一致［13］。但我们发现βcatenin在N1－2肺癌组和N0肺癌组中的表达差异无显著性，与相关文献描述不符［8－10］，不过 N1－2肺癌组有高胞质表达和低胞膜表达的趋势，其差异无显著性是否与样本量较少有关有待进一步研究。另外，肺鳞癌β－catenin的胞质表达低于肺腺癌，胞膜表达高于肺腺癌。肺癌细胞胞质及胞膜中β－catenin的表达高低与肿瘤的分化程度及肿瘤的转移倾向有关，本研究中对肺腺癌及鳞癌未进行病理分化分级，并且未进行术后随访，因此其胞质及胞膜表达差异是否与肺癌的组织学类型有关需要在进一步的研究中有待分析。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌离子依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解基底膜，促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。许多疾病如骨关节炎、多发性硬化、肿瘤等都伴随着 MMPs活性的改变，其中以MMPs在恶性肿瘤侵袭转移中的作用最引人注目［14］。MMP－2（matrix metalloproteinase－2，基质金属蛋白酶－2）是所有MMPs中分布最广的，当细胞恶变时，常有 MMP－2的升高［15］，其主要通过降解细胞外基质中的胶原蛋白（主要是IV型胶原蛋白）促进肿瘤细胞转移［16］，许多实验已经证实 MMP－2在NSCLC 中 表 达 异 常［17－19］。 李 红 梅 等［20］的 研 究 显示，转移能力相对较高的细胞系产生MMPs的能力强于转移能力相对较低的细胞系。MMP－2通过对细胞外基质及基底膜中Ⅳ型胶原的特异性降解，使肿瘤细胞浸润能力增强，发生转移的可能性增加。Suzuki等［21］用酶谱法和免疫组织化法在检测NSCLC组织中MMP－2和MMP－9的表达水平，结果MMP－2较MMP－9有更强的表达，故认为在肺癌中，MMP－2较MMP－9充当更重要的角色。

本实验证实，N1－2肺癌组 MMP－2的表达明显高于N0肺癌组，亦即MMP2的表达与NSCLC的淋巴结转移正相关，这与大多文献报道相同［22］。此外，MMP－2的表达与患者性别和年龄、肺癌组织类型、肿物大小无显著性差异也与文献描述相同［23］。本实验标本量不多，随访中部分病例失访，并且没有到3年及5年随访时间，很难进行有效随访统计。我们将在随后的大样本实验中做进一步完善。

我们还对肺癌组织中β－catenin胞质表达和胞膜表达与MMP－2表达之间的关系分别进行相关性分析，结果显示，β－catenin胞质表达和胞膜表达与MMP－2表达之间均无相关关系（P＞0.05），这一结果可能与本研究中肺鳞癌及肺腺癌组织样本量较少有关，需要在后期研究中通过大样本实验来进一步证实。田素芳［24］等的研究显示，胃腺癌组织中MMP－2的表达与β－catenin的膜表达呈负相关，与本实验结果相矛盾。据文献表述，β－catenin胞质表达异常增强与肿瘤的发生和侵袭有关，但其胞膜表达下调与肿瘤淋巴结及远隔转移的关系尚未得到确证［25］。MMP－2的作用靶点主要是IV型胶原蛋白，而在正常细胞中，β－catenin则通过参与构成上皮钙粘素—连环素复合体（E－cad－cat complex）限制肿瘤细胞的侵袭和转移。MMP－2表达上调和β－catenin胞膜表达缺失可能协同参与肿瘤细胞的转移过程，但二者之间的相关关系缺乏理论和实验数据支持。

综上所述，β－catenin和 MMP－2在肺癌的发生、发展和转移过程中均起到了不同程度的作用：βcatenin胞质表达上调激活Wnt信号转导途径，促进细胞增殖，抑制细胞分化，从而加速肺癌的发生和发展；MMP－2表达增强促进细胞外基质的破坏，因此提高了肿瘤细胞的侵袭和转移能力。MMP－2表达上调和β－catenin胞膜表达下调可能协同参与肿瘤细胞的转移过程，二者在肺癌转移过程中的作用是相加作用还是协同增强作用需要进一步研究及探讨。

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