静脉注射免疫球蛋白对宫内感染胎鼠脑组织Toll样受体4表达影响的实验研究

戴梦颖， 李晓捷， 孙奇峰

脑性瘫痪（简称脑瘫）是由于发育中胎儿或婴儿脑的非进行性损伤所致持续性运动和姿势发育异常、活动受限的一组综合征［1］。常并发感觉、知觉、认知、交流、行为紊乱、癫痫、继发性肌肉与骨骼问题。近年来大量临床观察与流行病学研究发现：脑白质损伤（white matter damage，WMD）作为引起脑瘫临床表现的重要原因，与宫内感染的关系极为密切。Toll样受体4（Toll－like receptor 4，TLR4）广泛分布在脑室周围血管丛、小胶质细胞和星形胶质细胞上，与中枢神经系统炎症反应关系密切，是革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的主要效应受体。本实验通过对宫内感染后孕鼠及时给予注 射 免 疫 球 蛋 白 （intravenous immune globulin，IVIG），观察子代鼠脑内TLR4表达量变化，以了解IVIG对宫内感染子鼠脑损伤的影响。

1 材料与方法

1．1 实验动物 清洁级成熟SD雌性大鼠40只，雄性大鼠20只，体质量300～500g，大连医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证：SCXK（辽）2008－0002。

1．2 实验材料 LPS为大肠埃希菌055：B5菌株（1mg／mL）（美国Sigma公司），TLR4多抗（美国Santa Cruz公司）。

1．3 动物分组 选取40只健康雌性SD大鼠，于发情期以2∶1比例与雄鼠合笼过夜，于次日观察到阴栓为孕第1日，孕鼠分笼喂养。按随机数字表法分为对照组8只，实验组16只，干预组16只。

1．4 实验方法

1．4．1 模型制备 LPS冻干粉溶于100mL灭菌生理盐水中，配成200mg／L溶液，震荡摇匀，4℃保存备用。分别在实验组及干预组孕鼠妊娠第17天时注射LPS 350μg／kg，以取材时观察到孕鼠子宫壁、胎盘充血水肿为造模成功。干预组于造模成功后3h取孕鼠后尾静脉注射IVIG 2g／kg 1次。

1．4．2 标本的留取及保存 各组于妊娠18、19、21d迅速处死1／4数量大鼠，冰盒上剖腹取胎鼠，称重后给予1%戊巴比妥腹腔注射后断头取脑。生后1d子鼠处理方法同胎鼠。一半数量的脑组织置于4%多聚甲醛（pH 7．2～7．4）中室温固定24h后进一步透明、包埋、制成蜡块并切片。雌鼠处死后取胎盘苏木精－伊红染色观察病理变化。另一部分取出后迅速放入液氮中，次日在放置到－70℃冰箱中长期保存。

1．5 观察指标

1．5．1 胎盘及幼鼠脑组织苏木精－伊红染色 取对照组、干预组和实验组各个时间点雌鼠胎盘组织及幼鼠脑组织甲醛固定后石蜡包埋切片，进行苏木精－伊红染色。

1．5．2 Real time－PCR法检测脑组织TLR4 将脑组织匀浆后提取总RNA，逆转录合成cDNA，将反应体系（cDNA 1μL，SYBR Greeen 10μL，上下游引物各0．5μL，DEPC－H2O 8μL）加入到7500型PCR仪反应板的反应孔中，按操作流程操作。β－actin引物序列上游5＇－ATT GGG GCA GTA GCA GAT GA－3＇，下游5＇－GGA AAT CGT GCG TGA CAT TA－3＇，退火温度为61℃。TLR4引物序列上游5＇－TCG TTT CTC ACC CAG TCC TC－3＇，下游5＇－TCA GTG TGC TTG TGG TAG CC－3＇，退火温度为59．8℃。

1．5．3 免疫组织化学法测定TLR4 各组石蜡包埋组织切片6张，片厚5μm，其中5张行TLR4免疫组织化学染色，1张用磷酸缓冲盐溶液代替一抗作阴性对照。用Image Pro Plus 4．5图像分析软件计数TLR4表达积分光密度（IOD）。每张切片选取6个位置相应但不重复的视野均值作为该片IOD，每组选取6张切片。

1．6 统计学方法 采用SPSS 19．0统计软件进行统计，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用LSD方法，多个均数之间两两比较采用SNK－q检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 孕鼠及子鼠情况 本次实验共纳入孕鼠40只，其中实验组及干预组各16只，对照组8只。注射前后各组孕鼠活动、摄食正常，无一例出现死亡。未提前剖宫产的孕鼠孕期均超过21d，无一例在剖宫产前出现阴道流血，活动减少等分娩迹象。实验组在注射LPS之后，胎鼠及幼鼠死亡数量逐渐增加。干预组胎鼠及幼鼠也出现一定数量的死亡数，但每个时间点死亡数量均较实验组低。对照组胎鼠及幼鼠死亡率最低。见表1。

表1 分组及子鼠数量情况（n）

2．2 体质量方面 实验组胎鼠及幼鼠在注射LPS后体质量增加幅度与对照组相比逐渐落后。干预组胎鼠及幼鼠体质量也出现增长幅度减小的现象，但减小程度不及实验组。实验组胎鼠剖出时颜色青紫，活动力差，刺激有反应。死胎则出现较严重水肿，且较活胎个头小。干预组胎鼠剖出后，颜色红，有主动张口等动作。对照组胎鼠剖出后颜色粉红，活动力强，能主动张口及运动四肢。子鼠体质量比较见表2。

表2 各组胎鼠及幼鼠体质量比较±s，g）

表2 各组胎鼠及幼鼠体质量比较±s，g）

注：与对照组比较，aP＜0．01；与干预组比较，b P＜0．01。

组别 妊娠18d 妊娠19d 妊娠21d 出生1d实验组 0．81±0．08ab 2．18±0．21ab 4．38±0．67a6．28±0．99a干预组 0．97±0．24a2．33±0．19a4．63±0．52a6．67±0．62对照组 1．10±0．14 2．56±0．46 5．41±0．62 6．83±0．59 F 25．74 19．71 19．89 5．03 P 0．00 0．00 0．00 0．01

2．3 胎盘组织病理切片 对照组胎盘组织色泽鲜红，血供丰富，可见大量滋养细胞与红细胞，毛细血管间质薄，无明显炎症细胞浸润。实验组血管间质明显增生变厚，管腔不规则，毛细血管腔狭小，血供减少，并可见大量炎性细胞浸润。干预组胎盘血供较实验组丰富，但仍可见炎性细胞，病理改变介于实验组和对照组之间。

2．4 脑组织病理切片 实验组鼠脑组织切片可见部位组织疏松，细胞成分明显减少，神经细胞间隙增宽，多为体积小、少突起、核小、深染、核仁不清的欠分化神经元，并有局灶性出血。白质内神经纤维走向紊乱、粗细不均匀。对照组早期无明显水肿细胞，后期细胞成分明显多于实验组，神经纤维纹理清晰，有条理。IVIG干预组早期神经元细胞水肿较实验组减轻，后期细胞成分也较实验组明显增多。

2．5 TLR4－mRNA 含量 实验组 TLR4－mRNA表达量在妊娠18d时达到高峰，与对照组和干预组比较差异有统计学意义（P＜0．01），随后逐渐降低。到妊娠21d时与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。干预组 TLR4－mRNA 在妊娠18d时出现一过性增高，妊娠19d时，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。至出生后1d，实验组和干预组再次出现增长高峰，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。见表3。

2．6 TLR4蛋白水平的测定 TLR4蛋白水平增加紧随TLR4－mRNA的增加而增加。实验组在检测的4个时间点内TLR4水平与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。干预组在妊娠18、19d出现TLR4显著增高后TLR4水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。见表3。

表3 各组胎鼠及幼鼠脑内不同时间TLR4蛋白和TLR4－mRNA的表达±s）

表3 各组胎鼠及幼鼠脑内不同时间TLR4蛋白和TLR4－mRNA的表达±s）

注：与对照组比较，aP＜0．01；与干预组比较，b P＜0．01。

组别TLR4－mRNA 的表达妊娠18d 妊娠19d 妊娠21d 出生1d TLR4蛋白水平妊娠18d 妊娠19d 妊娠21d 出生1d实验组 9．64±0．17ab 10．21±0．19ab 10．39±0．18 9．70±0．18ab 114 712±2 087ab 20 203±5 967ab 13 751±1 380ab 13 395±1 218ab干预组 10．26±0．11a10．45±0．27 10．30±0．38 11．10±0．30a 9 540±174a 12 718±2 791a10 842±1 620 9 387±511a对照组 11．18±0．45 10．56±0．47 10．24±0．34 12．44±0．43 8 301±620 8 752±769 9 374±634 7 129±671 F 158．64 6．54 0．82 378．64 123．16 40．70 40．50 235．78 P 0．00 0．03 0．45 0．00 0．00 0．00 0．00 0．00

3 讨论

WMD可以导致患儿出现脑瘫、癫痫、精神发育迟滞等问题。人WMD损伤的高危时间窗大约为23～34周，即在髓鞘形成之前，少突胶质细胞前体分化成熟的时期，所以本实验选择80%胎龄（大鼠的孕期一般在21～23d，即孕17d）进行干预。旨在直接造成WMD。

目前认为，宫内感染多由体内最常见的条件性致病菌大肠杆菌导致［2］，其LPS起重要作用。孕鼠出现宫内感染后，子宫及胎盘的供血不足，造成子鼠的体质量减轻［3］。本实验结果显示：由LPS造成的宫内感染，可导致子宫壁及胎盘的充血水肿，功能不良。而炎症反应对胎盘的功能影响又直接作用于胎鼠的血液循环，使其血压不稳，造成过量灌注或灌注不足，继而引起脑组织水肿或颅内出血。

LPS作为第一信使激活单核细胞系内的第二信号系统，使其释放大量TNF－α、IL－6等细胞因子，使得两屏障的通透性增加，造成LPS进入子鼠脑内。且宫内感染引起的循环低血压。与细胞因子的表达呈负相关［4］。这一系列的变化能直接上调TLR4－mRNA的表达［5］，使得脑内 TLR4的含量增加，小胶质细胞等细胞内的第二信使激活，释放大量细胞因子，造成少突胶质前体细胞损伤。

TLR4在胎龄1周时开始出现表达［6］。在神经系统中TLR4广泛分布在脑室周围血管丛、小胶质细胞、星型胶质细胞［6］，其中以小胶质细胞为主。小胶质细胞被广泛认为是神经系统内的主要免疫效应器［7］。LPS与TLR4结合后激活一系列细胞因子。进而对少突胶质前体细胞产生毒性作用，诱导其凋亡，影响髓鞘的形成，从而导致脑白质软化。Lehnardt等［7］发现LPS作用于先天TLR4缺陷的鼠不能引起少突胶质前体细胞降低，进而证实TLR4为LPS诱导少突胶质细胞损伤所必需。TLR4的表达量与入脑LPS的剂量和时间窗有关［8］。本实验选择LPS注射后24h进行观察，见24h时已经TLR4的水平升高的结果，其表达量逐渐减少。而出生后TLR4－mRNA的表达量又出现升高，考虑可能与子鼠宫内发育较差，经阴道分娩时出现再次缺氧有关。该结果与国外报道的：“经剖宫产产出的宫内感染患儿患WMD的概率减小”［9］的结果符合。

IgG可保护神经系统：在脑卒中的大鼠模型中，静脉注射IgG可以有效保护神经元，通过中和补体来达到减少受损神经元数目的目的［10］。大鼠脑中生理量的非特异性单体IgG可以通过增加神经小胶质细胞的内吞作用并释放肿瘤坏死因子等方式来起到保护神经细胞的作用。神经细胞本身所产生的IgG也参与到神经系统本身清除异己抗原的免疫反应中。在阿尔兹海默小鼠模型中发现IgG可以与FcRn协同作用［10］，清除中枢中的β肽淀粉样蛋白与抗β肽淀粉样蛋白的抗原抗体复合物。而存在于脑内的IgG可以使细菌更易受调理素作用，随之被小胶质细胞吞噬［10］。

本实验在LPS注射后3h给予IVIG干预。大量免疫球蛋白通过中和母血中LPS，减少透过胎盘屏障LPS的量，进而减少LPS入脑的量。由于LPS激活TLR4的过程有剂量依赖性，所以减少LPS入脑即减少了TLR4的表达，进而减轻了TLR4下游的整个炎症反应过程。同时由于IgG本身分子量小，部分IgG可入脑，继续中和脑内炎性因子和LPS，从而减轻炎性细胞因子对少突胶质前体细胞毒性作用所致的凋亡，为日后髓鞘的形成提供了细胞数量保障。

本实验通过减少第一信使，使第二信使的激活减少，引起效应细胞因子分泌量下降，而注射入体内的IgG本身又具有中和细胞因子的作用，从两条途径上减少对少突胶质前体细胞的毒性作用。保障脑组织正常髓鞘化，进而达到脑保护的作用。但由于神经细胞本身也有分泌IgG的能力［11］，发挥作用的IgG有多少来自于干预，多少源自神经组织自分泌还需做进一步的深入探讨。

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