碘海醇复合染料定位兔舌癌前哨淋巴结

徐秀寅 石芳 陈晓平 黄卫 沙炎 吴海涛

颈部淋巴结转移状态与头颈部肿瘤治疗方案及预后评估密切相关。舌癌、声门上型喉癌和下咽癌等容易出现颈淋巴结转移，隐匿转移率高达29%～50%［1-2］，这给临床治疗带来了很大困难。超声、CT、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正电子发射断层显像(positron emission tomography，PET)等是诊断颈淋巴结转移的常用方法，但迄今尚未见一种检查手段能够在术前准确诊断颈淋巴结的隐匿转移，目前只有通过前哨淋巴结活检才能对颈淋巴结的隐匿转移进行确诊。前哨淋巴结是指距离原发肿瘤周边最近的引流淋巴结，是肿瘤通过淋巴路播散时首先到达的一个或一组淋巴结。传统的前哨淋巴结活检方法主要有放射性核素定位法［3］和染料注射法［4］，并在头颈肿瘤前哨淋巴结活检中得到广泛应用。尽管放射性核素定位法和染料注射法各有优缺点，但临床证明两者结合应用要优于单独使用［5］。间接淋巴造影是定位前哨淋巴结的新方法，并在临床相关科室已得到应用［6］，但在头颈肿瘤方面未见临床研究报道。本实验利用建立新西兰白兔颈淋巴结反应性增生及VX2舌癌颈淋巴结转移模型，研究同时应用碘海醇(欧乃派克)和染料复合注射定位兔舌前哨淋巴结的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 健康成年新西兰白兔14只，雌雄不限，体质量2.0～3.0 kg，分为正常对照组(A 组)3只、兔颈淋巴结炎性肿大模型组(B组)8只和兔VX2舌癌颈淋巴结转移模型组(C组)3只。

1.2 方法

1)A组:健康成年新西兰白兔3只，未作任何处理，行间接淋巴造影扫描。

2)B组:健康成年新西兰白兔8只，麻醉后固定，保持颈部伸直。用5mL无菌注射器抽取乳胶(鸡蛋黄∶生理盐水=1∶1)，于右侧颈部相当于下颌下肌内注射0.5mL，制作兔颈淋巴结炎性肿大模型［7-8］，对侧不作处理。接种后隔11 d进行间接淋巴造影CT扫描。

3)C组:以无菌手术将种兔后腿肌内的肿瘤完整取下，去除周边的粘连组织，置入玻璃皿中。用生理盐水冲洗干净，切开肿瘤，避开肿瘤内坏死区，取肿瘤周边鱼肉样瘤组织，置入另一玻璃皿中，并放入适量生理盐水，用小剪刀尽量剪成1mm×1mm×1mm或更小的碎块，制成肿瘤组织块悬液。健康成年新西兰白兔3只，将兔全身麻醉后仰卧固定，牵拉出兔舌体，暴露舌腹，将0.3mL瘤组织悬液注射于每只兔舌腹左侧黏膜下制作颈淋巴结转移模型［7-8］。接种后实验室常规饲养，2周后进行间接淋巴造影CT扫描。

4)间接淋巴造影CT扫描:实验兔全身麻醉后仰卧固定，头颈伸直，牵拉出兔舌体，暴露舌腹。在间接淋巴造影之前先行兔颈部CT轴位平扫。CT平扫后，行间接淋巴造影CT。所用造影剂为纯碘海醇(A组)，或碘海醇与亚甲蓝(美蓝)混合液，或碘海醇与纳米炭混合液。碘海醇与美蓝或纳米炭混合液的体积比为1∶1。B组6只兔在双侧舌腹外侧注射碘海醇(安盛药业有限公司)与亚甲蓝(江苏济川制药有限公司)混合液各0.5mL，另外2只兔注射碘海醇与纳米炭(重庆莱美药业有限公司，粒径平均为129 nm)混合液各0.5mL。C组3只兔于一侧舌肿瘤周围黏膜下和另一侧无肿瘤的舌腹腹外侧各注射碘海醇与亚甲蓝混合液0.5mL。所有实验兔于注射后 1、5、15、20min 时进行轴位CT扫描。

扫描相关参数:CT型号为德国西门子公司的SOMATOM Sensation 10，管电压120 kv，管电流150 mA;准值10mm ×0.75mm;床进5.6mm/r，每圈用时0.75 s/r;矩阵 512×512，视野 7～12cm;层厚 0.75mm 或2mm，层距0.75mm或2mm;扫描范围从兔的舌体到胸骨柄前端，包括整个颈部，扫描层数42～46层，扫描时间10～13 s，采用轴位扫描。

5)染色前哨淋巴结解剖:B组6只兔和C组3只兔完成淋巴造影CT扫描后即处死，B组另外2只兔完成淋巴造影CT扫描后24 h处死。根据CT显影，解剖颈部，寻找蓝染或黑染的前哨淋巴结。所有实验兔颈淋巴结及舌部肿瘤均行常规组织病理学检查。

2 结果

2.1 间接淋巴造影CT扫描定位前哨淋巴结 在未注射造影剂前先行CT平扫，所有兔颈淋巴结均不能清晰显影。A组3只兔行淋巴造影扫描时，在兔一侧舌腹外侧注射碘海醇后，只有同侧淋巴管和颈淋巴结增强显影，而对侧淋巴管和颈淋巴结无增强显影。所有实验兔(B组8只和C组2只)，造影剂注射后见双侧输入淋巴管及颈部前哨淋巴结明显增强显影。在注射造影剂后1～5min达到最强增强效果，此后开始消退，15min时增强效果明显减弱，20min时造影剂显影基本消退，或完全消退。在所有实验兔中，每侧颈部仅有一枚淋巴结增强显影，增强显影的淋巴结位于喉气管旁(图1)。碘海醇和亚甲蓝混合液增强效果与碘海醇和纳米炭增强效果未见明显差异。在注射造影剂后整个过程中未见其他颈淋巴结增强显影，也未见有明显血管增强显影。

2.2 染料染色定位前哨淋巴结 间接淋巴造影CT扫描显示增强显影的淋巴结位于喉气管旁，以喉、气管为解剖标志，在CT扫描定位指引下解剖、寻找前哨淋巴结。B组6只和C组3只，每兔均在喉气管旁找到一枚蓝染淋巴结(图2)，B组另外2只也均在喉气管旁找到一枚黑染淋巴结。该蓝染或黑染淋巴结实际位置与间接淋巴造影CT定位的位置一致。淋巴结外侧淋巴门部蓝染或黑染较深，周围渐浅，内侧附于气管处蓝染甚浅甚至无蓝染。除蓝染或黑染淋巴结外，每只兔均可见蓝染或黑染的输入淋巴管。除颈淋巴结蓝染外，C组有1只兔出现单侧腮腺淋巴结蓝染(但该蓝染淋巴结CT未能显影)。

图1.淋巴结炎性肿大模型兔，红箭头所示为兔两侧颈部明显强化的椭圆形前哨淋巴结，表面光滑

图2.解剖所示的蓝染前哨淋巴结。该蓝染淋巴结实际位置与间接淋巴造影CT定位的位置一致

2.3 病理学观察 将解剖出的兔颈部淋巴结石蜡切片后行苏木素-伊红染色。检查结果显示:所有结节均为淋巴结。C组3只兔VX2舌肿瘤被病理证实，同侧前哨淋巴结内见转移灶(图3～4)，对侧前哨淋巴结内未发现转移灶。

图3.兔舌癌颈淋巴结转移模型兔，右侧前哨淋巴结椭圆形，左前哨淋巴结存在充盈缺损

图4.左前哨淋巴结病理检查见淋巴结存在转移灶(HE染色)

3 讨论

目前CT和MRI是诊断颈淋巴结转移的主要方法。CT和MRI主要依据颈淋巴结的大小诊断转移，但正常大小的淋巴结内隐匿转移，如无液化坏死等影像表现，CT和MRI都无法明确诊断。前哨淋巴结活检能明确颈淋巴结转移状态，但前哨淋巴结活检在头颈肿瘤临床治疗并不是常规手段。目前，前哨淋巴结定位的常用方法主要有放射性核素定位法和染料注射法，2种方法各有优缺点，但两者结合使用是目前定位前哨淋巴结的最佳方法，对头颈肿瘤前哨淋巴结的定位准确率达95%～100%［9-10］。然而，在未设置放射性核素科的医院因缺乏相关的专业设备，严重限制了放射性核素定位法在临床诊断上的应用。其次，放射性核素法需要注射放射性核素，这可能导致潜在的放射污染风险。另外，探测中的背景信号也可能影响结果，术中使用探针探测舌癌前哨淋巴结时，在转移灶与原发灶相邻较近时无法区分转移灶和原发灶，而且转移淋巴结只能为显示放射性核素浓集的点，影响前哨淋巴结的精确定位，更无法显示转移淋巴结的形态。因此，有学者建议首先切除瘤体组织，再用探针探测舌癌前哨淋巴结以避免背景信号干扰。所以临床迫切需要可替代放射性核素定位前哨淋巴结的其他有效定位方法。

淋巴造影结合CT和MRI检查是当今影像学发展的一个重要方向。如果没有放射性核素定位前哨淋巴结的相关设备，间接淋巴造影CT扫描可作为前哨淋巴结定位的一种新的备用方法。注射到组织间隙的水溶性造影剂能很快地扩散至毛细淋巴管，并能通过输入淋巴管引流至前哨淋巴结，继而通过输出淋巴管排出。这时，充盈造影剂的输入淋巴管、淋巴结和输出淋巴管在CT扫描时增强显影，与输入淋巴管相连的淋巴结即为前哨淋巴结。间接淋巴造影时，虽然可能有部分造影剂进入毛细血管，但对前哨淋巴结的辨认并无影响。本实验中观察到兔舌腹黏膜下注射造影剂后，双侧淋巴管及颈部淋巴结明显增强显影。在所有实验兔中，每侧颈部仅有一枚淋巴结增强显影，增强显影的淋巴结位于喉气管旁，与蓝染或黑染的颈深淋巴结位置一致，说明间接淋巴造影CT对明确蓝染淋巴结解剖位置具有指导作用。间接淋巴造影能选择性定位前哨淋巴结，除局部暂时肿胀外，亦未引发其他并发症［11］。虽然间接淋巴造影CT扫描在临床已被广泛应用于乳腺癌［12-13］、食管癌［14］、喉癌［15］等症状的前哨淋巴结定位，但迄今未见到间接淋巴造影定位头颈肿瘤前哨淋巴结的临床研究报道。我们建立兔颈淋巴结炎性模型和转移模型，采用间接淋巴结CT扫描定位前哨淋巴结，并取得了成功，这为头颈肿瘤前哨淋巴结研究提供了一种新思路。

然而，目前间接淋巴结CT扫描只能术前定位前哨淋巴结，术中还需解剖寻找。如皮下脂肪较厚时，术中寻找小淋巴结时，可能较困难，如能结合染料注射，术中更易找到蓝染的前哨淋巴结。本实验结果实现间接造影与染料定位同步进行，方便术中寻找前哨淋巴结。所以，间接淋巴结造影CT扫描结合染料注射优于间接淋巴结造影单独应用，我们的实验也证实了这一点。蓝染料注射法简单易行，然而亚甲蓝显影时间很短，不利于临床与间接淋巴结造影CT扫描同步进行。纳米炭混悬注射液为淋巴示踪剂［16］，具有吸附性能优良、淋巴靶向性极高、组织内滞留性和示踪速度良好、不进入血液循环等特点，无不良反应，注射到肿瘤局部组织后，可被巨噬细胞吞噬。由于毛细血管内皮细胞间隙为20～50 nm，而毛细淋巴管内皮细胞间隙为120～500 nm，且基膜发育不完全，故纳米炭粒未流经血管而迅速进入淋巴管，滞留集聚到淋巴结，数分钟内即可实现引流淋巴的活体染色，从而达到示踪淋巴的目的［17］。因而，其作为示综剂定位前哨淋巴结临床已被广泛使用，且显影时间可达数天，这有利于间接淋巴结造影和活性炭示综剂同时使用，方便前哨淋巴结定位操作。我们采用间接淋巴结造影和纳米炭混合液定位前哨淋巴结，CT扫描后24 h解剖前哨淋巴结时，黑染的淋巴结很容易被发现。所以，与间接淋巴结造影和亚甲蓝同时使用相比，间接淋巴结造影和活性炭同时应用定位前哨淋巴结更有利于临床操作。

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