CUL4在局限期小细胞肺癌中的表达及临床意义*

刘 蕊 李 慧 任秀宝

泛素（ubiquitin，Ub）-蛋白酶体降解系统广泛存在于真核细胞中，是细胞内ATP依赖的非溶酶体蛋白降解系统，由泛素激活酶（E1）、泛素转移酶（E2）和泛素连接酶（E3）共同完成，参与调控细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的活性，激活或抑制癌基因及抑癌基因的表达，从而直接或间接影响各种恶性肿瘤的发生。其中只有泛素连接酶识别底物具有特异性，所以目前的研究大多集中在E3上。CUL4家族包含CUL4A和CUL4B两个成员，因含一个环指结构域而具有E3的功能。CUL4A在多种肿瘤组织中过表达，其表达增加与不良预后相关，而CUL4B基因的突变与人类伴χ染色体的精神发育迟滞相关，但CUL4家族与局限期小细胞肺癌之间的关系鲜有报道。本研究利用免疫组织化学技术观察CUL4A、CUL4B在局限期小细胞肺癌组织芯片中的表达，并分析其与临床病理特征的关系，为局限期小细胞肺癌个体化治疗和预后判断提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集天津医科大学附属肿瘤医院2001年1月至2010年6月间资料完整且经病理诊断证实的局限期小细胞肺癌组织标本72例，其中男性48例（吸烟者31例占64.6%），女性24例（吸烟者5例占20.8%），中位年龄57（30～79）岁，以14例距离癌组织5cm以上的癌旁正常组织作为对照。

1.1.2 主要试剂 兔抗CUL4A购自美国BETHYL公司，兔抗CUL4B购自美国Proteintech Group公司，En⁃vision二步法免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片的构建 复习所有HE切片，选取代表性的区域并在蜡块上做标记，用内径为1.5 mm的空心管在每个蜡块标记处穿取组织，在空白蜡块上打孔（直径1.5 mm），将穿取的组织蜡块编号并依次排入空白蜡块的孔中，对蜡块进行4um连续切片，制成微阵列排列的组织芯片。

1.2.2 免疫组织化学染色 芯片常规脱蜡水化。在pH 6.0的0.01 mmol/L枸橼酸盐缓冲液中高压抗原修复，加一抗稀释液（CUL4A抗体稀释度为1:200；CUL4B抗体稀释度为1:100），4℃湿盒孵育过夜，加入二抗，DAB显色，苏木精复染。

1.2.3 结果判定 根据阳性细胞所占的百分比及阳性细胞染色强度用半定量免疫评分法来判定实验结果。1）染色强度：0分为无着色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色。2）阳性细胞所占的百分比：1分为阳性细胞≤25%；2分为26%～50%；3分为51%～75%；4分为76%～100%。染色强度与阳性细胞所占百分比的乘积：≤1分为免疫组织化学染色阴性，以乘积结果的中位数为分组点，≤4分为低表达，＞4分为高表达。

1.3 统计学处理

所有的统计均选用SPSS 16.0软件进行统计分析。计数资料的比较采用χ2检验和Fisher精确检验。以Kaplan-Meier法进行单因素分析，采用Log rank检验比较组间生存时间。应用Cox比例风险回归模型进行预后的多因素分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CUL4在局限期小细胞肺癌组织中过度表达

CUL4A阳性细胞着色定位于细胞核或细胞质，呈棕黄或棕褐色，72例癌组织中有52例阳性表达（72.2%），14例癌旁组织中有5例阳性表达（35.7%），差异具有统计学意义（P＜0.05，图1A）。CUL4B阳性细胞着色定位于细胞核，72例癌组织中有49例阳性表达（68.1%），14例癌旁组织中有4例阳性表达（28.6%），差异具有统计学意义（P＜0.05，图1B）。

图1 CUL4A和CUL4B在局限期小细胞肺癌组织和癌旁组织中的表达情况（DAB，×400）Figure 1 CUL4A and CUL4B expression in L-SCLC tissues and pa⁃ra-cancerous tissues（×400）

2.2 CUL4表达与L-SCLC临床病理特征的关系

CUL4A表达水平与患者吸烟情况密切相关。在吸烟患者中CUL4A高表达者占50.0%（18/36），明显高于不吸烟患者的22.2%（8/36），差异具有统计学意义（P＜0.05）。CUL4B的表达与患者性别、吸烟情况密切相关（P＜0.05）。在男性患者中CUL4B高表达者占45.8%（22/48），明显高于女性患者的12.5%（3/24），差异具有统计学意义（P＜0.05）。在吸烟患者中CUL4B高表达者占50.0%（18/36），明显高于不吸烟患者的19.4%（7/36），差异具有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 CUL4表达与局限期小细胞肺癌临床病理参数间的关系Table 1 Association of CUL4 with clinicopathologic characteristics of L-SCLC

2.3 CUL4表达与局限期小细胞肺癌预后的关系

单因素分析发现，淋巴结是否转移、CUL4A表达水平、CUL4B表达水平和血液LDH量均与患者的PFS和OS相关（表2）。CUL4A低表达组与高表达组相比，中位PFS显著延长（P＜0.05），中位OS显著延长（P＜0.05，图3）。CUL4B低表达组与高表达组相比，中位PFS显著延长（P＜0.05），中位OS显著延长（P＜0.05，图4）。多因素结果显示，CUL4B高表达是影响OS的独立危险因素，而淋巴结转移、血液LDH升高不仅是影响OS，也是影响PFS的独立危险因素（表3）。

表2 局限期小细胞肺癌患者预后影响因素的单因素分析Table 2 Univariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

表2 局限期小细胞肺癌患者预后影响因素的单因素分析（续表2）Table 2 Univariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

图3 CUL4A低表达组与高表达组的总生存曲线Figure 3 OS curve of low CUL4A expression group and high CUL4A ex⁃pression group

图4 CUL4B低表达组与高表达组的总生存曲线Figure 4 OS curve of low CUL4B expression group and high CUL4B ex⁃pression group

表3 局限期小细胞肺癌患者预后影响因素的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of clinical characteristics and survival in L-SCLC

3 讨论

目前认为，真核细胞内的蛋白质主要通过两种不同的蛋白酶解系统降解，溶酶体途径和泛素-蛋白酶途径。其中，约80%通过泛素-蛋白酶体途径降解。泛素连接酶是泛素-蛋白酶体系统的重要成分，其在癌形成过程中扮演着重要的角色［1］。CUL4是最新发现的一种泛素连接酶，CUL4家族包括结构和功能极具同源性的CUL4A和CUL4B两个成员。大量研究表明，CUL4A的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。CUL4A基因过表达最早发现于原发性乳腺癌中［2］，全基因组分析显示，5%的家族性乳腺癌和20%的三阴乳腺癌中检测到CUL4A基因过表达［3］。另外，原发性恶性胸膜间皮瘤［4］、卵巢癌［5］中也发现CUL4A基因过表达。体内研究进一步证实，CUL4A敲除的小鼠与野生型小鼠相比，能够显著抵御UV介导的皮肤癌的发生［6］。研究证实，CUL4B基因突变与人类伴×染色体的精神发育迟滞相关［7］，而CUL4B在肿瘤发生发展中的作用鲜有报道。

本研究应用免疫组织化学技术检测CUL4A、CUL4B在局限期小细胞肺癌和癌旁正常组织中的表达水平。结果显示：CUL4A和CUL4B在癌组织中的阳性率均明显高于癌旁正常组织，表明CUL4A、CUL4B基因的表达增高可促使肿瘤的发生。

分析局限期小细胞肺癌组织中CUL4A、CUL4B蛋白表达与临床病理特征关系，显示CUL4A表达水平与吸烟情况密切相关。CUL4B的表达与性别、吸烟情况密切相关。流行病学研究证实，烟草中的多环芳烃及亚硝胺类等致癌物可导致Ras、p53、Rb等基因点突变及C-Met基因构成型激活等分子异常，进而导致肺癌的发生［8］。CUL4家族高表达与患者吸烟情况密切相关，提示其可能与烟草中的致癌物在小细胞肺癌的发生发展中具有紧密联系。CUL4家族与吸烟导致肺癌的通路研究有待深入。而CUL4B在男性患者中显著高表达可能与本研究中男性吸烟患者比例高于女性（64.6%vs.28.8%）有关。

另外，本研究对CUL4表达与局限期小细胞肺癌预后关系的单因素分析结果显示，淋巴结是否转移、CUL4A表达水平、CUL4B表达水平和血液LDH量均与患者的PFS和OS相关。CUL4A、CUL4B低表达组与高表达组相比，中位PFS和中位OS均显著延长。多因素结果显示，CUL4B高表达是影响OS的独立危险因素，而淋巴结转移、血液LDH升高不仅是影响OS，也是影响PFS的独立危险因素。目前认为，LDH升高与肿瘤负荷呈正相关。本研究显示LDH升高不仅是影响OS，也是影响PFS的独立危险因素，是小细胞肺癌患者预后不良的重要因素之一，与李勇等［9］的报道一致，而高表达CUL4家族的患者无进展生存期和总生存期显著缩短，也与Schindl等［10］在乳腺癌患者中观察的结果相符。

研究证实CUL4可降解细胞周期抑制蛋白P21、P27［11-12］；CUL4 也参与细胞凋亡蛋白 P53降解［13］；另外，CUL4可降解一系列肿瘤抑制蛋白，如Merlin蛋白［14］，mTOR通路抑制因子REDD1［15］等。表明CLU4 可通过参与调控细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的活性，激活或抑制癌基因及抑癌基因的表达，从而直接或间接影响各种恶性肿瘤的发生发展。CUL4家族在局限期小细胞肺癌发生发展中的具体作用和分子机制需通过分子生物学实验进一步研究证实。

综上所述，CUL4家族在局限期小细胞肺癌的发生发展中起到重要作用。其与患者的吸烟情况及预后密切相关，可以作为预测局限期小细胞肺癌术后复发、转移及预后的分子标记物，并为局限期小细胞肺癌的靶向治疗提供依据。

1 Lee J,Zhou P.Cullins and cancer[J].Genes Cancer,2010,1(7):690-699.

2 Chen LC,Manjeshwar S,Lu Y,et al.The human homologue for the Caenorhabditis elegans cul-4 gene is amplified and overexpressed in primary breast cancers[J].Cancer Res,1998,58(16):3677-3683.

3 Melchor L,Saucedo-Cuevas LP,Munoz-Repeto I,et al.Compre⁃hensive characterization of the DNA amplification at 13q34 in hu⁃man breast cancer reveals TFDP1 and CUL4A as likely candidate target genes[J].Breast Cancer Res,2009,11(6):R86.

4 Hung MS,Mao JH,Xu Z,et al.Cul4A is an oncogene in malig⁃nant pleural mesothelioma[J].J Cell Mol Med,2011,15(2):350-358.

5 Beroukhim R,Mermel CH,Porter D,et al.The landscape of somat⁃ic copy-number alteration across human cancers[J].Nature,2010,463(7283):899-905.

6 Liu L,Lee S,Zhang J,et al.CUL4A abrogation augments DNA damage response and protection against skin carcinogenesis[J].Mol Cell,2009,34(4):451-460.

7 Badura-Stronka M,Jamsheer A,Materna-Kiryluk A,et al.A novel nonsense mutation in CUL4B gene in three brothers with X-linked mental retardation syndrome[J].Clin Genet,2010,77(2):141-144.

8 Lodovici M,Bigagli E.Biomarkers of induced active and passive smoking damage[J].Int J Environ Res Public Health,2009,6(3):874-888.

9 李 勇,张湘茹,孙 燕.小细胞肺癌患者预后的多因素分析[J].中国肺癌杂志,2006(6):525-529.

10 Schindl M,Gnant M,Schoppmann SF,et al.Overexpression of the human homologue for Caenorhabditis elegans cul-4 gene is associ⁃ated with poor outcome in node-negative breast cancer[J].Antican⁃cer Res,2007,27(2):949-952.

11 Abbas T,Sivaprasad U,Terai K,et al.PCNA-dependent regula⁃tion of p21 ubiquitylation and degradation via the CRL4Cdt2 ubiq⁃uitin ligase complex[J].Genes Dev,2008,22(18):2496-2506.

12 Li B,Jia N,Kapur R,et al.Cul4A targets p27 for degradation and regulates proliferation,cell cycle exit,and differentiation during erythropoiesis[J].Blood,2006,107(11):4291-4299.

13 Ren S,Xu C,Cui Z,et al.Oncogenic CUL4A determines the re⁃sponse to thalidomide treatment in prostate cancer[J].J Mol Med(Berl),2012,90(10):1121-1132.

14 Li W,You L,Cooper J,et al.Merlin/NF2 suppresses tumorigenesis by inhibiting the E3 ubiquitin ligase CRL4(DCAF1)in the nucleus[J].Cell,2010,140(4):477-490.

15 Lee J,Zhou P.Pathogenic Role of the CRL4 Ubiquitin Ligase in Human Disease[J].Front Oncol,2012,2:21.