芹菜素增强阿司匹林对结肠癌细胞的增殖抑制作用及其机制研究*

刘 斌 刘太香 白 明 王 伟 刘 锐 邓 婷 周礼鲲巴 一

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康［1］。COX-2在结肠癌发生中发挥关键作用，其抑制剂阿司匹林已经成为结肠癌防治的重要药物［2］，临床试验证明它在结肠癌的防治中具有确切作用，但是长期服用引起的胃肠道出血等不良反应制约了其临床应用［3-4］。食物黄酮类化合物是广泛存在于植物中的无毒、具有多种生物活性的天然化合物。芹菜素是一种在蔬菜、水果、茶叶中含量丰富的黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎症等多种生物活性，并且对COX-2有抑制作用［5］。本实验旨在观察芹菜素能否增强阿司匹林对结肠癌细胞增殖的抑制，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HT-29、HCA-7、Moser和DLD-1细胞由南京大学生命科学院赠送。COX-2（4842）、IκBα（9242S）抗体购自Cell Signaling公司。GAPDH（MB001）抗体购自Bioworld Technology公司。MTT、阿司匹林（A5376）和芹菜素（10798-25Mg）购自Sigma-Aldrich公司。TNF-α购自北京义翘神州生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HT-29、HCA-7、Moser与DLD-1细胞分别在含有10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酸、非必需氨基酸和丙酮酸钠的DMEM或1640高糖培养基中培养。所有细胞系均在37℃、5%CO2湿化培养箱中培养。

1.2.2 MTT实验 细胞以5×103个的密度种植在96孔板中。处理细胞后加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，培养箱中放置4 h后，在酶标仪上以570 nm的波长检测OD值，计算细胞增殖抑制率=（对照孔OD均值-试验孔OD均值）/（对照孔OD均值-空白孔OD均值）×100%。

1.2.3 免疫印迹法检测蛋白表达 以1×105个的密度将细胞种植在6孔板中，不同药物处理细胞后以裂解液裂解细胞，离心后用SDS-PAGE分离胶分离上清中的蛋白质并转移到PDF膜上，用相应的一抗和二抗孵育后收集图像。

1.2.4 RT-PCR检测mRNA水平 以1×105个的密度将细胞种植在6孔板中，不同处理方式处理细胞后用Trizol法提取细胞总RNA，之后进行RT-PCR，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳并收集图像。COX-2的正向引物为5'-GGGAAGCCTTCTCTAACCTC-3'，反向引物为5'-CTGCTTGTCTGGAACAACTG-3'，退火温度为60℃。GAPDH的正向引物为5'-ACCACAGTCCAT⁃GCCATCAC-3'，反向引物为 5'-TCCACCACCCTGTT⁃GCTGTA-3'，退火温度为60℃。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 芹菜素增强阿司匹林对结肠癌细胞增殖的抑制

用MTT法检测细胞存活率，结果显示，处理细胞72 h后，对表达COX-2的HT-29、HCT-7和Moser细胞，芹菜素对细胞的增殖抑制率为17%～27%，不同浓度阿司匹林对细胞增殖的抑制率为3%～41%，联合应用则对细胞增殖的抑制率达30%～73%；对不表达COX-2的DLD-1细胞，单独或联合应用对增殖抑制率无明显影响（图1A）。另外，在24、48、72 h分别检测不同处理方式对表达COX-2的HT-29、HCT-7和Moser细胞的增殖的影响，结果显示，处理48、72 h后，芹菜素明显增强阿司匹林对细胞增殖的抑制（图1B）。这提示，芹菜素能增强阿司匹林对结肠癌细胞增殖的抑制，并且此作用可能依赖于COX-2。另外，对以上计量资料结果进行统计学分析显示，芹菜素与阿司匹林对结肠癌细胞增殖的抑制存在协同增强作用。

2.2 不同结肠癌细胞系中COX-2表达水平的检测

由于COX-2在结肠癌发展中有重要作用，用免疫印迹法检测不同结肠癌细胞系中COX-2的表达水平（图2）。结果显示，COX-2在HCA-7、Moser、HT-29细胞中表达，而在DLD-1细胞中未检测到。

2.3 芹菜素对结肠癌细胞COX-2表达的抑制

选用表达COX-2的Moser细胞系来检测芹菜素对COX-2表达的抑制。用不同浓度的芹菜素处理细胞，48 h后免疫印迹法检测COX-2的表达（图3）。结果显示，芹菜素能够剂量依赖性地抑制Moser细胞系中COX-2的表达。

图2 不同结肠癌细胞系中COX-2的表达Figure 2 Expression of COX-2 in different colorectal cancer cell lines

图3 芹菜素抑制Moser细胞中COX-2的表达Figure 3 Apigenin inhibits the expression of COX-2 in Moser cells

2.4 芹菜素增强阿司匹林对COX-2表达的抑制

由于COX-2在结肠癌发展中有重要作用，而且本研究已经证明芹菜素能抑制结肠癌细胞中COX-2的表达，接下来用免疫印迹法和RT-PCR检测芹菜素和阿司匹林对COX-2表达的影响。结果显示，处理细胞48 h后，在蛋白（图4A）和mRNA（图4B）水平上，芹菜素增强阿司匹林对COX-2表达的抑制。此结果提示，芹菜素增强阿司匹林抑制结肠癌细胞增殖是通过抑制COX-2的表达实现的。

图4 芹菜素增强阿司匹林对Moser细胞中COX-2表达的抑制Figure 4 Apigenin enhances the aspirin-mediated inhibition of COX-2 expression in Moser cells

2.5 芹菜素增强阿司匹林对TNF-α诱导的IκBα降解的抑制

由于NF-κB的入核和转录活性可以调节COX-2的表达，本研究用芹菜素与阿司匹林处理Moser细胞2 h后，用3 ng/mL的TNF-α处理30 min，然后用免疫印迹法检测IκBα的降解情况。结果显示，芹菜素增强阿司匹林对由TNF-α诱导的IκBα降解的抑制（图5）。提示芹菜素增强阿司匹林对结肠癌细胞COX-2表达的抑制可能是通过抑制IκBα的降解，进而抑制NF-κB的入核和转录活性而实现的。

图5 芹菜素增强阿司匹林对Moser细胞中IκBα降解的抑制Figure 5 Apigenin enhances the aspirin-mediated inhibition of IκBα degradation in Moser cells

3 讨论

COX主要包括COX-1和COX-2，在肿瘤形成过程中COX-2能被诱导性表达，对结直肠癌的发生具有重要作用［2，6］。人们发现在人结直肠癌和结直肠癌动物模型中COX-2的表达均上调，而且升高的COX-2与较差的生存率有关。COX-2促癌机制包括促进细胞增殖，抑制凋亡，促进肿瘤血管生成，增加肿瘤的播散等［7-8］。

NF-κB在结直肠癌的进展中尤为重要，NF-κB的组成性活化明显增加结直肠癌的风险［3］。大多数结直肠癌存在NF-κB等转录因子的组成性活化［7-8］。在未受刺激时，NF-κB可被其特异性抑制剂IκB抑制而以非活化状态存在于细胞质中。IKKβ被激活后能磷酸化IκB，导致IκB的降解，游离出NF-κB（主要是p50/p65）迁移到细胞核，调节COX-2等基因的转录而促进结直肠癌的发展［7，9］。因此，NF-κB是结直肠癌的一个重要的治疗靶点［9-10］。

阿司匹林是非选择性COX抑制剂，可以选择性乙酰化COX上的丝氨酸位点而不可逆地灭活COX，然而阿司匹林发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制COX-2的活性而实现的。此外，阿司匹林还可以通过抑制COX-1以及非COX依赖性的机制而发挥抗肿瘤作用［3-4，11］。流行病学研究发现，经常使用阿司匹林能够减少高表达COX-2的人群的结直肠癌的风险，能降低已确诊的结直肠癌患者（尤其是高表达COX-2）的疾病特异性死亡率，但是对COX-2弱或无表达的结直肠癌的风险并无影响［12-13］。阿司匹林还能抑制NF-κB对COX-2的转录活性。研究显示，阿司匹林能抑制TNF诱导的NF-κB激活，抑制IKK活性和IκBα的降解，能剂量依赖性地抑制NF-κB调节的COX-2等的表达而抑制肿瘤细胞的增殖［14］。

流行病学研究显示，结直肠癌的发生率与摄入黄酮类化合物的量负相关［5］。多种食物黄酮类化合物能抑制NF-κB的活化，调节COX-2的表达，从而影响包括结直肠癌在内的肿瘤细胞的增殖［6-7，14］。芹菜素是一种黄酮类化合物，单独应用即对多种肿瘤起到明显的抑制作用。其中，芹菜素抑制NF-κB活化，调节COX-2表达，抑制肿瘤细胞增殖是它发挥抗肿瘤作用的重要机制［5-6］。有研究显示，芹菜素可通过非p53依赖性凋亡抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，还能通过诱导乳腺癌T47D细胞p53依赖性凋亡及G2/M期阻滞而抑制增殖［15-16］。人们每天从饮食中可以摄入大量芹菜素，有报道显示，斯堪的纳维亚人的每日摄入量达75～81 mg［5］。摄入2 g/kg体重的欧芹（7.2±1.3）h后，芹菜素的血浆浓度可达（127±81）nmol/L［17-18］。

本研究选择了HT-29、HCA-7、Moser和DLD-1结肠癌细胞系，经验证，HT-29、HCA-7和Moser细胞中检测到COX-2的表达，而DLD-1细胞中未检测到。用阿司匹林与芹菜素单独或联合处理细胞，发现联合处理组明显抑制前三种细胞增殖，经统计学分析，芹菜素和阿司匹林对抑制细胞增殖具有协同增强作用。本研究发现芹菜素能剂量依赖性地抑制COX-2的组成性表达，在蛋白和mRNA水平上，芹菜素能增强阿司匹林对COX-2表达的抑制。进一步研究发现，芹菜素增强阿司匹林对由TNF-α诱导的IκBα降解的抑制。因此，本研究推论，芹菜素增强阿司匹林抗结肠癌作用的机制是：芹菜素增加阿司匹林对IκBα降解的抑制，抑制NF-κB入核和 NF-κB对COX-2表达的调控，进而抑制结肠癌细胞的增殖。本实验中芹菜素的有效浓度是10 μmol/L，高于此前报道的人体摄入芹菜素后的血浆浓度，提示将本研究结果应用于临床还需要进一步研究。

综上所述，本文首次发现芹菜素能增加阿司匹林的抗结肠癌作用，并探讨了其作用机制。对芹菜素进行深入研究和开发，对于提高阿司匹林的抗肿瘤作用，降低阿司匹林的剂量以及减少阿司匹林引起的不良反应具有重要意义。

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